海洋环境中群体淬灭酶资源的发掘及其酶学性质和催化机制的研究

Plant bacterial diseases cause serious losses to agriculture every year. The pathogenic abilities of their pathogens are regulated by quorum sensing (QS) system, and interfered or attenuated by quorum quenching. Enzyme that targets the signal molecules with quorum quenching function can degrade such molecules and interfere the pathogenic gene expression, which thus plays a role in prevention and treatment of diseases. Screening of enzymes with high activity and application value is a hot research topic currently. This research aimed to isolate and study the enzyme resources being capable of degrading signal molecules from marine environment. The applicant has obtained 5 unreported bacterial strains that own degrading activity towards signal molecules. In the next step, high-throughput screening system would be used to isolate novel genes that encode degrading enzymes, and enzymatic properties and catalytic bases of these enzymes would be further studied. The research of this project would be helpful for collecting degrading enzymes with high activity, achieving biological control of plant bacterial diseases, understanding physiological function and ecological role of signal degrading enzymes and facilitating theoretical research of quorum quenching.

植物的细菌性病害每年给农业生产造成严重损失，很多病原菌的致病能力受群体感应系统调控，也能被群体淬灭机制干扰和减弱。具有群体淬灭功能的信号分子降解酶能水解信号分子，进而干扰致病基因的表达，起到防治病害的作用。筛选有实际应用价值的高活性信号降解酶是目前生物防治领域的研究热点之一。本项目致力于从海洋环境中发掘具有群体淬灭功能的酶并进行进一步的研究。申请人已从海洋环境中筛选到了5株未被报道过的具有信号分子降解活性的细菌，接下来，拟利用高通量筛选系统，从中分离发掘新的信号分子降解酶基因，并对其酶学性质、催化机理等进行深入研究。本课题的研究有助于获得高活性信号降解酶，促进植物细菌性病害生物防治的实现，也有助于理解信号分子降解酶在生物体内的生理功能及其在生态环境中扮演的角色，促进群体淬灭现象的基础研究。

课题批准后，申请人先后开展了以下几个方面的研究工作：. 1）新的群体淬灭细菌的发掘和鉴定.根据前面发现的具有群体淬灭活性的5株菌的种属分布，从DSMZ菌种保藏中心又购买了7株相关的菌，进行了群体淬灭活性的测定。首次发现了食烷菌中普遍存在有信号分子淬灭活性，拓宽了信号分析降解酶的来源，有助于分析食烷菌的生理功能和生态功能。.2）Fosmid文库构建、筛选和目标基因的克隆.选择盐单胞菌1339作为研究目标，成功构建了Fosmid文库，并筛选了3000左右单克隆，得到了3个具有活性的阳性克隆并找到了正确的编码区域。对于目标ORF进行克隆和外源表达，检测到了预期的群体淬灭活性，从而确定了具体的基因序列。.3）盐单胞菌群体淬灭酶的性质研究. 对上述筛选到的盐单胞菌群体淬灭酶从基因序列、进化关系、酶学性质和结构特点等方面进行了一系列研究，并对其结构进行了模拟，有助于全面深入理解该酶的相关性质、为其进一步应用提供了理论依据。.4）克雷伯氏肺炎杆菌群体感应系统缺失对合成2,3-丁二醇的影响.申请人发现克雷伯氏肺炎杆菌也具有群体感应系统，但对其生理功能的研究较少。申请人尝试失活了其群体感应系统，发现失去了群体感应功能的突变株利用同样浓度的葡萄糖合成2,3-丁二醇的能力提高了47.75%，同时主要副产物的浓度大幅降低。该研究首次发现了群体感应对于工业微生物发酵产品的合成具有重要影响，该发现具有非常重要的理论价值和经济价值，相关的研究正在更深入的进行中。.总结：. 在国家基金委的支持下，经过三年的研究，申请人筛选得到了两个信号分子降解酶，并对其中一个的种群分布、酶学性质、进化关系等做了深入的分析研究，相关工作内容已申请专利一项、发表中文论文两篇，完成英文文章一篇，正在投稿中。在研究过程中，申请人还发现群体感性系统对于工业微生物的产物合成具有重要影响，并做了相关研究，相关内容已发表中文论文一篇，其他更深入研究工作正在抓紧进行，以期形成系统的研究成果，为群体感性系统在工业领域的研究提供新的思路。