牛SRY基因促进雄性卵裂期胚胎增殖分化的分子机理研究

In mammals,male embryonic development is faster than that of female;this phenomenon is closely related to the SRY gene on haplotype Y-chromosome. For the male bovine embryo,the expression of SRY gene may influence,in a sex-specific manner the proliferation and differentiation of the cleavage-stage embryonic stem cells.In vivo and IVF sexing bovine embryos were produced with high purity XY frozen semen and were used as research objects.The SRY mRNA and SRY protein localization and quantification of XY (XX) embryos during the different cleavage stages,as well as the SRY protein-DNA Interaction and SRY protein-proteins were investigated by the techniques of the quantitative PCR,chromatin immunoprecipitation assay(CHIP), (Co-Immunoprecipitation(COIP) and immunofluorescence labeling;the epigenetic differences among XY and XX embryos of the cleavage-stage were researched by the techniques of the gene methylation,embryonic telomerase length analysis and mtDNA quantification.Finally,the function of promoting embryomic cell proliferation and differentiation for SRY gene will be proved,the causes and mechanism of XY and XX embryos development differences in cleavage stage will be explained and illustrated.It is important to reveal the new function and mechanism (beyond sex determination) on promoting early male embryonic development for SRY gene.

哺乳动物在性别决定前雄性胚胎比雌性胚胎发育更快，这个现象与雄性胚胎单倍型Y染色体上的SRY基因有密切关联，而牛雄性早期胚胎中表达的SRY基因可能以性别特异性的方式对卵裂期胚胎干细胞的增生分化产生影响。利用牛高纯度分选X和Y冷冻精液生产性别控制的体内和体外受精胚胎，运用定量PCR、染色质免疫沉淀、蛋白免疫共沉淀和免疫荧光标记技术，研究XY（XX）胚胎不同卵裂期SRY mRNA和SRY蛋白的定位、定量以及SRY蛋白与DNA 作用和蛋白质相互作用；采用表观遗传学研究方法，分析卵裂期XY（XX）胚胎SRY基因甲基化作用及端粒酶长度和线粒体数量的表观遗传学差异。最终确定SRY基因促进早期胚胎细胞增生分化的作用，进而发现SRY基因促进XY早期胚胎发育的新功能和新作用机理。而明确SRY基因导致卵裂期XY与XX胚胎增殖发育差异的机理，对揭示SRY基因性别决定外功能亦有重要意义。

哺乳动物在性别决定前雄性胚胎比雌性胚胎发育更快，这个现象与雄性胚胎单倍型Y染色体上的SRY基因有密切关联，牛雄性早期胚胎中表达的SRY基因可能以性别特异性的方式对卵裂期胚胎干细胞的增生分化产生影响。利用X和Y冷冻精液生产不同性别体内和体外胚胎，运用定量PCR、免疫共沉淀和免疫荧光标记技术，研究胚胎不同卵裂期SRY mRNA和SRY蛋白的定位、定量以及SRY蛋白与DNA作用和蛋白质相互作用；采用表观遗传学研究方法，分析卵裂期XY（XX）胚胎SRY基因甲基化作用及端粒酶长度和线粒体数量的表观遗传学差异。得到以下结果：对雌性及雄性胚胎碘化丙啶染色后，细胞计数，雄性胚胎细胞数为131.10±9.37高于雌性囊胚期胚胎细胞数的116.90±7.45，差异极显著。扩增线粒体DNA单拷贝基因cox1，采用荧光定量PCR法检测雄性及雌性胚胎线粒体DNA拷贝数。建立了实时荧光定量PCR检测牛囊胚期胚胎线粒体DNA拷贝数的方法；结果表明雄性囊胚期胚胎线粒体DNA拷贝数为897223±76723，雌性囊胚期胚胎线粒体拷贝数为693452±45236，牛囊胚期雄性胚胎线粒体DNA拷贝数极显著高于雌性胚胎（P＜0.01）。对29枚雄性胚胎和27枚雌性胚胎采用实时荧光定量方法测定两性胚胎相对端粒长度，发现雄性囊胚期胚胎相对端粒长度为1.00±0.10，雌性囊胚期胚胎相对端粒长度为1.23±0.26，雌性胚胎相对端粒长度显著高于雄性胚胎（P＜0.05）。采集8-细胞，16-细胞，桑椹胚时期胚胎进行单细胞转录组测序；用DEGSeq软件分析差异表达基因，以FC>2or<0.5且Q-value<0.05为筛选标准，8-细胞VS16-细胞筛选到170条DEGs，16-细胞VS桑椹胚筛选找到417条DEGs，8-细胞VS桑椹胚筛选到126条DEGs。GO生物功能分析发现，主要涉及核苷酸化合物合成、代谢调节等生物过程。KEGG分析结果显示，8-细胞VS16-细胞DEGs参与到126条通路中，显著富集在11条代谢通路；16-细胞VS桑椹胚DEGs参与到206条代谢通路；8-细胞VS桑椹胚DEGs无显著富集代谢通路。研究最终确定SRY基因促进早期胚胎细胞增生分化的作用，发现SRY基因促进XY早期胚胎发育的新功能和新作用机理。对揭示SRY基因性别决定外功能具有重要意义。