Hsa-miR-146在TLR介导牙周炎症反应的调控作用及机制初探

牙周炎是微生物引起的感染性疾病。由于具体致病机理尚不明了，导致治疗手段匮乏，局限于机械性治疗，缺乏有效调控宿主免疫的治疗。miRNA可通过转录后水平调节mRNA表达，调节炎症免疫等多重功能，但其表达具有组织特异性。目前未见其在牙龈组织中表达状况及对牙周炎症反应调控作用的报道，需展开深入研究。.本课题组前期工作以芯片比较炎症与健康牙龈组织，筛选出了数条炎症相关miRNA，其中miR-146与牙周TLR信号传导关系密切。本研究以miRNA为切入点，拟检测各种炎症程度及牙周炎类型的牙龈组织中炎症相关miRNA表达状况，为继续探讨牙周炎个性化治疗提供实验数据。并以miR-146为新视点，采用基因转染、蛋白印迹、定量PCR和ELISA等分子生物学方法，探讨miR-146在TLR介导牙周炎症反应的调节作用，并初步阐明miR-146对TLR介导炎症信号通路的调控机理，为深入探索牙周免疫治疗提供新思。

背景： miRNA可以调控各种炎症和免疫反应，但其对牙周炎症调控作用不甚清晰。在人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts, HGFs)，Toll样受体4(Toll like receptors 4, TLR4)可识别细菌脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)激活下游信号并引起炎症因子释放。本研究的目的是先从各种类型、不同炎症程度牙龈组织筛选牙周炎相关miRNAs，然后检测HGFs内miRNA-146表达，并探索LPS诱导下miRNA-146对HGFs TLR4信号传导的调控作用。.方法：（1）miRNA芯片方法比较健康与炎症牙龈组织中miRNA表达谱差异，筛选出与牙周炎症、免疫关系密切的miRNAs，检测慢性牙周炎（Chronic Periodontitis, CP）、侵袭性牙周炎（Aggressive Periodontitis, AgP）轻、中、重度炎症牙龈组织中炎症相关miRNAs表达差异。（2）酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测转染miRNA-146a/b抑制剂前后HGFs白介素-1β(IL-1β), 白介素-6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)表达水平的变化。并用western blot和定量PCR的方法检测miRNA-146可能的靶分子IRAK1和TRAF6的表达。荧光素酶报告检测miRNA-146是否可以直接结合IRAK1的3’-UTR（3）HGFs经P.g LPS刺激后，western blot检测TLR4信号通路上的激酶，用相应抑制剂和激活剂阻断或激活相应激酶，观察miRNA-146a/b、IL-1、IL-6和TNF-α等表达水平。.结果：（1）炎症和健康牙龈存在明显不同的miRNAs表达谱，91条miRNAs表达上调＞2.0倍， 34条miRNAs下调2~5倍。其中与炎症反应关系密切有12条miRNAs；CP和AgP轻、中、重度炎症牙龈组织中炎症相关miRNAs表达均存在明显差异；（2）miRNA-146a/b在P.g LPS刺激前后表达差异明显，抑制miRNA-146a和miRNA-146b-5p水平会导致IL-1、IL-6和TNF-α分泌增加，IRAK1的mRNA和蛋白水平也呈现上调，但TRAF6表达无明显变化