TGF-β1介导泡型包虫病患者肝脏NK细胞免疫耐受机制研究

Alveolar echinococcosis (AE) is characterized by the tumor-like growth of Echinococcus multicularis (Em). Very little is known about the immune tolerance mechanism induced by Em infection. In our previous study, we found that the host liver TGF-β1 expression increased after Em infection, whereas the percentage of NK cells decreased significantly. The inverse correlation between TGF-β1 and proportion of NK cells, suggest that Em immune escospe may be caused by TGF-β1 inducing NK cells exhaustion, of which mechanism, very little is known to date. The aim of this work or project is to cultivate NK cells by in vitro, and clear effect TGF-β1 on NK cell phenotype, cell cycle and function by adding the hTGF-β1 cytokines or TGF-β1 neutralizing antibodies; Secondly, establishing a Em infection mice model, we elucidate the key role in immune tolerance and its molecular mechanism of liver NK/NKT cells innate immune response in Em infection by way of reverse cell clearance and forward adoptive transfer. Finally, using clinical AE operation on liver specimens and peripheral blood, we would clarify the functional changes of NK cells and the clinical manifestations, which reveal the liver immune tolerance mechanism of NK cell mediated by TGF-β1 in AE patients, and the feasibility of AE patients clinical treatment by blocking-up. These results will have important scientific significance for deepening the study of the pathogenic mechanism and exploring the new immunotherapeutic strategies of AE.

泡型包虫病（AE）是泡球蚴（Em）寄生肝脏所致“类肝癌样”致死性寄生虫病，Em诱导的免疫耐受机制未见报道。我们前期研究发现，Em感染后诱导宿主肝脏TGF-β1高表达，而NK细胞的比例明显降低，两者呈现出负相关性，提示TGF-β1可能通过诱导NK细胞耗竭造成Em免疫逃逸，但机制不明。本项目拟通过体外培养NK细胞，添加hTGF-β1细胞因子刺激或TGF-β1中和抗体，明确TGF-β1对NK细胞表型、细胞周期和功能的影响；其次建立Em感染小鼠模型，采用反向细胞清除和正向过继转输方式，明确肝脏NK/NKT细胞天然免疫应答在泡球蚴感染所致免疫耐受过程中的关键作用及其分子机制。利用临床AE肝脏手术标本和外周血，确定NK细胞的功能变化和临床表现，明确TGF-β1介导泡球蚴感染所致肝脏NK细胞免疫耐受机制及其阻断对AE病人的临床治疗的可行性，对深化AE致病机制的研究和探讨新的免疫治疗策略具有重要科学意义。

泡型包虫病是多房棘球绦虫幼虫感染人体所致的一种恶性致死的寄生虫病，有“寄生虫癌症”之称。目前大量的研究工作表明，多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis，E.m）感染宿主后可以导致机体处于免疫耐受状态，从而逃避宿主免疫系统攻击。本研究旨在探讨经典负调控因子TGF-β介导肝AE患者NK细胞功能异常的机制。首先通过动物模型研究，利用流式细胞技术动态观察分析感染不同时间段小鼠肝脏NK细胞表面受体的表达情况及功能变化，感染后2周、4周、12周感染组小鼠肝脏NK细胞百分比和分泌分泌IFN-γ的功能明显降低（P<0.05），但感染后24周两组差异无统计学意义（P＞0.05）。感染后2、4周时间段CD27+CD11b+NK（NK细胞成熟过程的功能最强的细胞亚群）的百分比显著低于对照组（P＜0.05）。NK细胞清除后小鼠肝脏内病灶数量、体积及肝脏总质量明显大于对照组（P<0.05）。NK细胞抑制性受体（NKG2A）和Ly49A表达明显上调（P＜0.05）。其次，通过临床肝脏组织标本，发现总NK细胞和CD56brightNK细胞在近端（CLT）和远端（DLT）组织内百分比无明显变化（P＞0.05），但是CD56dimNK在总NK细胞里占百分比在CLT明显降低（P＜0.05）。病灶周围产生“炎症微环境”，对比远端肝脏组织，近旁肝脏组织表达KIR2DL1比例相对要更高一些（P＜0.05），AE患者近旁肝脏组织KIR2DL1分子在CD56+NK细胞里表达比例更高（P＜0.05）；KIR2DL1+NK细胞群近旁肝脏组织分泌效应分子IFN-γ、GranzymeB比例显著低于远端肝脏组织（P＜0.05）。最后，使用正常志愿者外周血，纯化NK细胞，在体外通过经典负调控因子TGF-β1刺激后抑制性受体NKG2A的表达明显增高，NK细胞分泌IFN-γ功能和NKG2A+NK细胞分泌IFN-γ功能明显降低（P＜0.05）。AE患者肝脏区域免疫中，作为机体抵御外来病原体入侵的第一线细胞NK细胞通过经典负调控因子TGF-β的作用下导致抑制性受体KIR2DL1、NKG2A等表达上调，从而传到抑制性信号传递，导致肝脏局部NK细胞免疫功能耗竭，造成多房棘球蚴感染在宿主肝脏的慢性寄生，长期共存。