在HBVcccDNA形成过程中细胞DNA修复系统的作用

An indispensable feature of hepadnavirus replication is that the relaxed circular viral genome (RC-DNA) requires to be converted to covalently closed circular DNA (ccc DNA) in the nucleus. cccDNA serves as the template for all viral RNA transcription. At present, the reverse transcriptase inhibitors can not remove the cccDNA in the clinic trial. As a result, the effective treatment is facing severe challenges. As an important member of cellular DNA repair systems,topoisomerasehas a common characteristic: transesterification via the DNA phosphate backbone. Our preliminary study found that type Ⅱ tyrosine-DNA phosphodiesterase (TdpⅡ) could cut tyrosine phosphodiester bond in the DHBV RC-DNA coupling P protein, and formed cccDNA precursor molecule"deproteinized RC-DNA". All data suggest that DNA repair systems participate in the formation of cccDNA. The project will reconstruct intermediate steps of HBV cccDNA formation in vitro, and comprehensively.investigate the role of important members of DNA repair systems including Tdp, 5'-flanking endonuclease, DNApolβ, δ, ε and ligase I, IIIα and related repair proteins in the formation of cccDNA for the first time. The study has scientific significance to explore HBV replication, and design specific drug target for the cccDNA.

嗜肝DNA病毒复制的一个重要特征，就是寄主细胞核内RC-DNA转化成高度稳定的充当病毒转录模板的cccDNA。目前，临床使用的反转录酶抑制剂不能清除cccDNA，使治疗面临严峻挑战。细胞DNA修复系统的重要成员拓扑异构酶具有与DNA磷酸骨架发生转酯反应的特性。我们前期研究发现，Ⅱ型酪氨酸-DNA磷酸二酯酶(Tdp2)能切开DHBV/HBV RC-DNA中与P蛋白偶联的酪氨酸磷酸二酯键，形成cccDNA前体分子即“无蛋白质的游离RC-DNA”。所有数据提示细胞DNA修复系统参与cccDNA形成。本项目体外重建形成HBV cccDNA的中间步骤，并首次全面调查DNA修复系统的重要成员Tdp家族、5'-侧翼内切酶、DNApolβ、δ、ε及连接酶I、IIIα和相关修复蛋白在形成cccDNA中的作用。该研究对理解HBV复制有重要科学意义，为设计针对cccDNA特异性药物靶标提供理论指导。

乙型肝炎病毒（HBV）复制的一个重要特征，就是寄主细胞核内RC-DNA转化成高度稳定的充当病毒转录模板的cccDNA，且肝损伤及肝细胞癌的发生对HBV的复制产生重要的影响。目前，临床使用的反转录酶抑制剂不能清除cccDNA，使治疗面临严峻挑战。cccDNA是由是由其前体松弛环状DNA（RC-DNA）转换而来，但参与的宿主因子仍未确定。调节肝损伤及肝癌的发生机制也仍不清楚。我们研究发现，5'-侧翼内切酶（FEN1）、DNApolβ及连接酶IIIα参与了HBV RC-DNA向cccDNA的转换。同时证明了lncRNA LINC00662通过激活Wnt/ß-catenin信号传导促进M2巨噬细胞极化和肝细胞癌的机制及GAAS减弱免疫介导的肝脏伤害的机制。关于FEN1，在HepAD38细胞模型中，PTPD（3-hydroxy-5-methyl-1-phenylthieno[2,3-d]pyrimidine-2,4(1H,3 H)-dione）作为FEN1的抑制剂，抑制FEN1的外切酶活性。用PTPD处理HepAD38细胞，在不影响细胞增殖的情况下PTPD能显著减少cccDNA的生成量，而对病毒的反转录水平、胞内及分泌到胞外的病毒DNA量没有影响。用针对FEN1的siRNA转染HepAD38细胞，减少了FEN1的表达。检测胞内cccDNA的生成量，发现胞内cccDNA生成量降低而rcDNA生成量没有变化。FEN1的突变体（D181A）没有外切酶活性，用嵌合有野生型及突变型FEN1基因的质粒转染HepAD38细胞，转染嵌合有野生型基因质粒的细胞产生cccDNA多，转染嵌合有突变型基因质粒的细胞产生的cccDNA少。利用体外HBV cccDNA形成体系，用DNApolβ、δ、ε每个分别替代BstDNA聚合酶，用连接酶I及连接酶IIIα每个分别替代T4DNA连接酶。初步证明了DNApolβ及连接酶IIIα参与了HBV RC-DNA向cccDNA的转换。同时证明了长非编码 RNA LINC00662通过激活Wnt/ß -catenin 信号传导诱发肝细胞癌及GAAS通过调节肝脏Th细胞的平衡来抑制肝细胞凋亡进而减轻肝脏损伤。该研究对解读缓解肝损伤、肝癌发生及HBV复制有重要科学意义，为设计针对cccDNA特异性药物靶标提供理论指导。