福氏志贺菌2a新毒力蛋白Pic细胞毒性的分子机理研究

Shigella flexneri 2a new effector Pic, which belongs to serine protease autotransporter family (SPATEs), has been found to exhibit a cytopathic effect (CPE) on Hela cells in our previous studies, and the CPE could be inhibited by serine protease inhibitor PMSF. Pic’s cytotoxicity may depend on its functional serine protease motif with host target protein, and the mechanism is unknown. To screen and identify the host cell target protein interaction with Pic, the yeast two-hybrid system and pull-down assay will be used in this project and further molecular mechanisms of Pic-host cell interactions will be explored. These results will provide a thorough understanding of Shigella pathogenesis and a better understanding of SPATEs’ contributions to enteropathogenetic infection.

Pic是近年来新发现的效应蛋白，由福氏志贺菌2a产生，为丝氨酸蛋白酶自动转运家族成员（SPATEs）。本课题组在以往的研究中首次发现Pic能引起Hela细胞发生病变效应，且蛋白酶抑制剂PMSF能抑制这种效应，因此推测Pic的细胞毒性功能可能与丝氨酸蛋白酶水解活性有关。与Pic作用的宿主细胞蛋白尚不清楚，细胞毒性功能的分子机制尚待进一步研究。本项目拟采用酵母双杂交等技术寻找Pic相互作用的宿主细胞靶蛋白及其基因，寻找并确定这种相互作用的功能域，探讨可能的生化机制，并进一步考察这种相互作用对细菌在宿主细胞内生存和繁殖的影响以及对宿主细胞自身信号转导通路和相关表型的影响，探讨可能的分子机制。上述研究结果有助于阐明福氏志贺菌2a新毒力蛋白Pic与宿主细胞相互作用的分子机制，丰富对志贺菌致病机理的全面认识以及对肠道致病菌新毒力因子SPATEs的深入认识。

研究背景、内容及方法：.细菌性痢疾是感染性腹泻的重要原因，志贺菌是菌痢最常见的病原菌，致病力强，无有效疫苗，致病机制未完全明确。丝氨酸蛋白酶自动转运家族(SPATES) 是福氏志贺菌及其它致病性肠道菌中新发现的毒力因子，生物学功能复杂多样。我们先前的研究表明SPATES家族成员Pic能引起HeLa细胞病变效应，具体机制不明。本课题旨在阐明Pic与宿主细胞相互作用的分子机制。具体采用CoIP-MS等技术寻找与Pic相互作用的靶蛋白及其基因，确定相互作用功能域，探讨可能的生化机制；利用流式细胞、激光共聚焦等技术考察该相互作用对细菌在宿主细胞内生存繁殖的影响及对宿主细胞信号转导通路和相关表型的影响。完成上述研究将全面阐明Pic和肠道致病菌新毒力因子SPATES的生物学功能，揭示志贺菌及整个肠道致病菌的致病机制，为开发疫苗和设计抗菌药物靶点提供新思路。.重要结果及科学意义：.1. 通过CoIP-MS技术，筛选到303个可能的宿主细胞靶蛋白;.2. 从中挑选3个目标蛋白Cdc42，CD99和Utf1进行下一步验证，证明Pic与Cdc42，CD99和Utf1均存在相互作用：Pic和Cdc42相互作用的功能域大致在Pic301-600，这一区域虽然包含了Pic丝氨酸蛋白酶活性位点，但实验证明这一相互作用与Pic水解酶活性无关；Pic对CD99的水解作用与Pic的丝氨酸蛋白酶活性有关，同时与CD99 O-糖基化有关；功能学研究证明，pic缺失突变株感染HeLa细胞导致Cdc42更趋向细胞表面分布；.3. 为研究重组蛋白Pic进入宿主细胞后与核转录因子Utf1相互作用的功能学效应，自主研发了pH响应型纳米材料，以便将蛋白质、核酸等生物活性大分子从细胞外运输至细胞内发挥作用。试验证明，该纳米材料对细胞没有毒性，能有效将Pic等生物大分子载入细胞内并完整释放，发挥相应生物学功能，该研究论文已发表在SCI杂志International Journal of Nanomedicine上（2区，IF=4.33）;.4. 运用上述纳米材料将Pic成功导入宫颈癌细胞HeLa中，引起明显的CPE。Western blotting表明，转染Pic的HeLa细胞Utf1含量明显降低，提示Pic可能通过抑制utf1基因表达或降解Utf1蛋白而抑制某些肿瘤细胞的增殖，为新型抗癌药物的研发提供新思路。