PRAK对T淋巴细胞线粒体稳态调控的机制研究

As a self-regulation for adapting the relatively high partial oxygen pressure in peripheral micro-environment, limiting reactive oxygen species (ROS) by reducing mitochondria content is implied to be the mechanism for T cells to survival in the periphery but how it is regulated is largely unknown. The p38-regulated/activated protein kinase (PRAK) is a newly identified member of the family of Mitogen-activated protein kinases (MAPK) which is uniquely positioned as a downstream substrate of both canonical and non-canonical MAPK pathways. Previous studies have shown an important role of PRAK in tumor pathogenesis and energy metabolism.Our previous studies have shown that the mitochondria content of the recent thymic emigrants (RTE) and naïve T cell could not decrease and the survival ability of RTE and naïve T cell impaired with reduced peripheral T cell numbers in the PRAK deficiency mouse, indicating the important role of PRAK in the mitochondrial regulation of T cells.In this study, with this PRAK deficiency mouse model, we aim to further study the exact mechanism of PRAK in the regulation of mitochondria of T cell and the associated signal transduction pathway which will facilitate to fully understand the physiological function of PRAK and the significance of mitochondrial homeostasis for T cell viability and development.

T淋巴细胞在胸腺发育成熟向外周迁出后，为适应外周微环境中相对较高的氧分压，将下调胞内线粒体含量以减少活性氧的产生，维持细胞正常生理活动。但T细胞线粒体稳态的调控机制及信号通路并未知晓。PRAK是最近被发现的唯一既能被p38激活参与经典MAPK通路又能被ERK3/4激活参与非经典MAPK通路的分子，在肿瘤生长及细胞能量代谢方面发挥重要作用。但PRAK在免疫系统的功能还没有报道。我们前期研究发现PRAK基因敲除小鼠RTE及naïve T细胞不能有效下调胞内线粒体数目，导致细胞存活能力降低及外周T细胞数目减少，提示PRAK在T细胞线粒体稳态调控方面可能发挥重要作用。本课题将利用PRAK基因敲除小鼠模型深入探究其对T淋巴细胞线粒体稳态的调控作用，包括对T细胞内线粒体数目及功能的影响、作用机制及信号通路，进一步阐明线粒体稳态对T细胞发育及存活的生理意义并拓展对PRAK生理功能的认识。

与胸腺内未成熟的T相比，外周成熟T细胞内线粒体数目明显减少, 这一生理现象发生的原因及机制不明确。我们研究发现p38调节/活化的蛋白激酶（PRAK）在线粒体下调过程中发挥重要作用。首先，我们通过检测不同发育阶段T细胞胞内线粒体数目发现，在T细胞刚刚从胸腺迁出即新近迁出胸腺细胞（RTE）阶段，开始下调胞内线粒体数目，而PRAK敲除小鼠的RTE细胞中线粒体数目下调受阻，即PRAK敲除小鼠的外周T细胞线粒体仍然维持在较高水平。对线粒体功能研究发现，PRAK敲除小鼠外周T细胞线粒体膜电位降低，呼吸链功能受损，并伴随线粒体形态改变，提示其线粒体功能障碍。PRAK缺失造成的线粒体稳态失衡直接导致了T细胞存活能力降低，外周T细胞数目减少。鉴于自噬在线粒体稳态维持方面发挥重要作用，我们推测PRAK缺失T细胞中线粒体异常可能源于自噬功能的缺陷。本研究结果显示，PRAK缺失T细胞自噬相关蛋白LC3-II水平明显下降，p62水平升高，细胞内自噬体数目减少，线粒体自噬相关蛋白Pink表达降低，提示PRAK在T细胞线粒体自噬中发挥关键作用。提高细胞自噬水平后，PRAK缺失T细胞存活能力显著改善。既往研究表明mTOR复合物在自噬中发挥重要调控作用，PRAK能被p38MAPK活化，继而通过Rheb最终抑制mTOR活性。因此，我们推测mTOR信号通路可能在T细胞线粒体调控中也发挥重要作用。本研究显示，PRAK缺失T细胞内S6K1和4EBP1磷酸化水平显著上升，Rheb的磷酸化显著减低，p38MAPK磷酸化水平增高，提示PRAK缺失有助于解除Rheb对mTOR抑制，升高胞内mTOR水平，从而抑制细胞自噬。应用雷帕霉素处理PRAK敲除小鼠后发现，其T细胞自噬水平升高，线粒体数目减少，同时细胞存活能力显著改善。综上所述，本项研究证明RTE细胞必须经历由PRAK介导的线粒体自噬以应对环境氧分压变化，该过程对细胞存活至关重要。更重要的是，本项研究揭示了一个新的氧化应激激发细胞自噬的信号通路：高ROS水平激活p38MAPK及其下游的PRAK，PRAK磷酸化Rheb，抑制mTORC1活性，最终启动自噬。除T细胞外，体内其它迁移细胞，包括血行转移的肿瘤细胞都可能面临类似的挑战，故而该机制可能具有普遍意义。