CEA联合4-1BBL基因疫苗抗大肠癌的实验研究

CEA为靶抗原的肿瘤疫苗研究近几年有了较大发展，多种疫苗形式可不同程度地激发特异性的CTL应答，但临床疗效仍较差，目前认为难以引起高强度的免疫应答反应是疫苗失败的重要原因。课题组先前构建了含大鼠4-1BBL重组减毒沙门氏菌（SL3261），该疫苗菌灌服荷瘤大鼠具有增强细胞免疫功能，同时对大肠癌生长有一定的抑制作用。本研究旨在4-1BBL基础上联合CEA，构建含既能诱导特异性抗肿瘤免疫反应（CEA基因），又可增强该反应强度（4-1BBL基因）的pIRES-CEA-4-1BBL重组质粒并转化SL3261，将该疫苗菌灌服大鼠，通过ELISA、FCM、定量RT-PCR和免疫荧光方法对细胞因子、细胞表型和目标蛋白表达等的检测，评估疫苗对免疫功能的影响，利用1，2二甲肼建立大肠癌模型，将疫苗菌灌服荷瘤大鼠，检测疫苗对荷瘤大鼠免疫功能的影响，常规病理方法观察对肿瘤的抑制作用，为大肠癌疫苗研究提供新思路。

4-1BB/4-1BBL是机体中一对重要的共刺激分子，在抗原提呈细胞(APCs)向T细胞提呈抗原时作为第二信号参与免疫反应， 4-1BBL的逆向信号对APCs具有活化的作用，4-1BBL同T细胞表面的4-1BB结合后提供共刺激信号，因此4-1BB/ 4-1BBL这对共刺激分子可以起到增强免疫的功能。4-1BBL除了作为第二信号参与机体免疫反应外，还直接与表达于树突状细胞、T细胞和NK细胞的4-1BB结合，具有抗凋亡和增强细胞活性的作用。CEA为靶抗原的肿瘤疫苗研究近几年有了较大发展，多种疫苗形式可不同程度地激发特异性的CTL应答，但临床疗效仍较差，目前认为难以引起高强度的免疫应答反应是疫苗失败的重要原因。.本研究利用分子生物学技术构建重组质粒：pIRES-CEACAM6、pIRES -4-1BBL、pIRES-CEACAM6 -4-1BBL，并通过脂质体转染COS7细胞，证明重组质粒能在哺乳动物细胞内成功转录表达目前基因。将质粒转入鼠沙门氏菌（LB5000）进行甲基化，利用修饰后质粒转化终宿主菌SL3261，获得稳定细菌pIRES/SL3261和疫苗菌pIRES-CEACAM6/SL3261、pIRES-4-1BBL/SL3261、pIRES-CEACAM6-4-1BBL/SL3261。利用1,2-二甲肼连续18周皮下注射建立大鼠大肠癌模型，第8周后间隔2周根据分组连续灌服4次含质粒减毒沙门氏菌，18周处死全部大鼠，结果表明含基因的实验组较对照组成瘤数量明显减少、以含双基因组更为明显，转移和Dukes分期也有类似结果。流式细胞仪检测外周血和和脾脏中细胞表型并利用PHA刺激脾细胞分泌IFN-γ水平，免疫组织化学法检测大肠、脾脏和肝脏等组织中淋巴细胞表型外周血和脾脏细胞表型检测显示活化T细胞较其它荷瘤组明显增高，脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力也明显增强。.含有CEACAM6和4-1BBL双基因的重组减毒沙门氏菌可能通过提高CD3+CD8+ T细胞和NK细胞的浸润,减少Foxp3细胞表达，促进Th1极化，抑制Th2及Th17极化，诱导特异与非特异性免疫，并打破免疫抑制微环境的机制来抑制肠道肿瘤。通过研究双基因疫苗的全身免疫反应，含有CEACAM6和4-1BBL双基因的重组减毒沙门氏菌可以刺激机体产生特异与非特异性的抗肿瘤免疫。