肿瘤相关巨噬细胞B7-H4基因5'-UTR区基因多态性对乳腺癌肿瘤细胞影响的研究

Breast cancer is one of the most common malignant tumors in females. Recent research highlights the role of macrophages on development and progression of breast cancer. As an important component of innate immune system, macrophage can inhibit tumor growth. However, it is just one side of the story. Under certain micro-environment, these tumor associated macrophages even can inhibit normal immune responses to the tumor cells, hence enhance tumor progression. Both the factors within the micro-environment and surface molecule expressed by macrophage determine the The bi-functional role of macrophages on tumor. B7-H4, a member of B7 co-stimulatory molecule family, is expressed on the surface of macrophage and can inhibit immune responses. Our previous data have shown that the polymorphisms of 5'-untranslated region (5'-UTR) in B7-H4 gene were highly associated with the risk of breast cancer by analysis of case-control. In order to further investigate the functional role of B7-H4 5'-UTR polymorphisms in macrophages, we proposed this project first to analyze the relationship between the 5'-UTR polymorphisms and B7-H4 expression on macrophages, second to determine how macrophages with different B7-H4 genotypes response to breast cancer microenviroment and finally to explore the impact of 5'-UTR of B7-H4 on breast cancer microenviroment. Our aim is to clarify the relationship of polymorphisms among B7-H4 gene polymorphism, macrophages and breast cancer and hence providing the potential but attractive therapeutic target.

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，巨噬细胞在其发生发展过程中的作用备受关注。作为固有免疫系统的重要组成部分，巨噬细胞对于肿瘤的作用不再只是传统意义上的抑制生长，而是特定的微环境下，能够促进肿瘤的发生发展。巨噬细胞对肿瘤的双重作用，主要通过微环境诱导，由表达在其表面的免疫活性分子来实现。B7-H4是协同刺激分子B7家族成员之一，其表达于巨噬细胞表面，能够抑制机体免疫应答。我们的前期工作确定了B7-H4分子5'-UTR区基因多态性与乳腺癌发病高度相关。为进一步探讨该位点基因多态性对乳腺癌组织中巨噬细胞的影响，本研究拟通过分析B7-H4分子5'-UTR区不同基因型对巨噬细胞B7-H4表达的影响、携带不同基因型的乳腺癌患者巨噬细胞对微环境的反应性，和不同基因型对肿瘤微环境的影响三方面来阐明B7-H4基因多态性、巨噬细胞、乳腺癌三者之间的联系，为寻找针对B7-H4基因以及巨噬细胞治疗乳腺癌提供新的思路。

在先前的研究中发现B7-H4基因5’-UTR区的rs3738414位点与乳腺癌的发病风险具有相关性，本研究通过5’-UTR区不同突变碱基的B7-H4表达质粒的构建，应用双荧光素酶报告系统对rs3738414位点对B7-H4表达的影响进行试验；本研究还对乳腺癌微环境中B7-H4的表达进行了检测，并检测了微环境中巨噬细胞表达B7-H4的情况；本研究将人单核细胞系THP1及外周血CD14+单核细胞体外诱导为不同极化的M1及M2型细胞，观察不同极化类型的巨噬细胞表达B7-H4的差异；本研究还对乳腺癌微环境中及不同极化巨噬细胞培养上清中IL-6及IL-10对巨噬细胞表达B7-H4的影响进行了相关研究。本研究还进一步探讨了IL-6及IL-10在巨噬细胞中与B7-H4表达的关联性。通过以上研究我们发现：B7-H4基因5’-UTR区的rs3738414 SNP位点的单碱基突变对B7-H4的表达情况并未发现有影响（P>0.05）。研究发现对比于远端癌旁组织，乳腺癌组织中B7-H4呈现高表达；且微环境中巨噬细胞也表达B7-H4。体外实验对THP1及外周血单核细胞诱导为M1及M2型后发现两种极化的巨噬细胞都表达B7-H4，且M2表达量较M1型稍高。通过ELISA方法检测发现IL-6及IL-10在乳腺癌微组织中表达量高于远端癌旁乳腺组织，且体外诱导M1及M2培养液上清中IL-6与IL-10的量也有差异；通过siRNA干扰B7-H4后发现，体外诱导M1及M2培养液上清中IL-6及IL-10的表达量未发现明显变化。在M1及M2型细胞培养体系中分别加入不同浓度IL-6及IL-10后，发现IL-6对M1细胞表达B7-H4并无影响，但IL-10可以增加M2细胞表达B7-H4，未发现有浓度依赖性；通过应用IL-6受体和IL-10受体的中和抗体，我们发现阻断IL-6R对M1细胞表达B7-H4无影响，但阻断IL-10R可降低M2细胞表达B7-H4。通过本研究可以对乳腺癌微环境中巨噬细胞与B7-H4和IL-10之间建立一定的联系，对于IL-10与B7-H4之间的信号转导的研究提供前期研究基础，也为B7-H4作为乳腺癌的诊断治疗的靶点的可能性提供数据理论依据。由于探讨B7-H4基因5’-UTR区的rs3738414 SNP位点并未发现具有功能性，因此我们会继续进行新的共刺激分子家族成员基因功能性SNP的筛选。