microRNA对17α-甲基睾酮抑制稀有鮈鲫卵泡发育的调控机制

17α-methyltestosterone (MT), a synthetic model androgen, interferes with the hormonal system of vertebrate and invertebrate organisms. Our study indicated that short exposure of MT influenced transcript profiling of steroidogenic enzyme and inhibited development of follicle in adult Gobiocypris rarus. In order to further understand the influence of MT in G. rarus, we will employ different concentration of MT (25, 50 and 100 ng/L) exposure G. rarus 7 days. The body weight and body length of fish were firstly measured. Following sampling, the ovaries tissues were weighed. And the gonadosomatic index was calculated using gonad weight and body weight. Then formalin-fixed gonads were dehydrated and processed for paraffin wax embedding. Serial longitudinal sections with thickness of 7 μm were cut with a rotary microtome and stained using hematoxylin-eosin (HE). RNA-seq would obtain the library of mRNA and the microRNA, respectively. Using qRT-PCR verify the specific miRNA about the reproduction of G. rarus. Luciferase assay verification of miRNA candidate target genes. Forecasting regulation MT in the ovaries of G. rarus steroid hormones related signaling pathway. Indicate the regulation of miRNA in ovarian development of G. rarus exposure to MT. We will clarify MT inhibits ovaries of G. rarus on molecular mechanism. Our study will provide theoretical foundation for environmental monitoring and environmental protection.

17a-甲基睾酮（MT）是一类典型的环境雄激素，广泛存在于环境中，严重威胁动植物和人类的健康。前期研究表明，MT短期暴露影响类固醇激素合成相关酶类基因StAR等的表达和血清中雌激素和雄激素水平，阻碍卵泡成熟。本项目采用不同浓度（25, 50和100 ng/L）的MT处理稀有鮈鲫雌鱼7 d。计算性腺指数，组织切片观察卵泡成熟度。高通量测序技术（RNA-seq）对处理组和对照组雌鱼卵巢进行mRNA和miRNA测序，通过系统整合miRNA和mRNA数据，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证所筛选的miRNA，荧光素酶报告系统验证miRNA的候选靶基因，预测参与调控MT抑制稀有鮈鲫卵泡成熟和类固醇激素合成相关的信号通路，揭示miRNA对卵泡发育的调控作用，从miRNA角度出发，阐明MT抑制稀有鮈鲫卵泡发育的分子机理，为环境监测和环境保护提供理论依据。

17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）也是环境内分泌干扰物的一员，它是一种人工合成的雄激素，随着养殖业和医疗业的发展，越累越多的MT被人们释放到环境中，日积月累，随着地表径流等途径，这些MT会进入到水环境中，随后对水生动物和植物造成严重的影响。因此，本项目采用不同浓度MT（25、50和100 ng/L）处理中国本土鱼类稀有鮈鲫雌鱼7 d，旨在研究MT在稀有鮈鲫雌鱼体内的作用途径及机理。MT处理7 d，我们首先测量处理组和对照组稀有鮈鲫体长、体重、全长、性腺重，并且计算性腺指数GSI。研究结果表明，50 ng/L的MT处理组显著抑制稀有鮈鲫雌鱼的体重和体长。而不同浓度MT处理组稀有鮈鲫卵巢重量均显著降低，处理组稀有鮈鲫雌鱼与对照组相比，性腺指数也显著降低。本项目采用石蜡组织切片的方法观察了MT处理组和对照组稀有鮈鲫卵巢形态，结果表明对照组卵巢组织切片无任何异常，而MT不同浓度处理组卵巢组织切片结果显示，成熟卵细胞（Voc）减少，未成熟卵母细胞（Poc）比例增多。采用ELISA方法研究MT对稀有鮈鲫体内VTG及激素水平的影响发现，25 ng/L的MT处理7 d，稀有鮈鲫体内FSH、LH、11-KT和T水平显著下降。而50 ng/L的MT处理7 d，稀有鮈鲫体内FSH、LH、11-KT和T水平显著升高。高通量测序结果表明，本研究获得73449个unigene，24个已知miRNA和897个新miRNA。5233 （MT25）、1663（MT50）和1222 （MT100-F） 转录组测序结果显示，MT处理组与对照组相比，分别有5233（MT 25）、1663（MT 50）和1222（MT 100）个差异基因。miRNA测序结果显示，不同浓度MT处理组与对照组相比，分别获得76（MT 25）、27（MT 50）和 73（MT 100）差异显著miRNA。实时荧光定量PCR验证miRNAs (miR-19、miR-183、miR-203、miR-204、miR-205、miR-96) 和6 个差异显著基因表达 (fabp3、mfap4、abca1、foxo3、tgfb1、zfp36l1) 及相关性，结果显示MT对miR-183和miR-203显著影响，miRNA-mRNA联合分析结果将为卵巢发育调控和免疫调节提供重要信息和可靠的理论依据。