青海地区产气荚膜梭菌生物被膜形成分子机制及其与耐药相关性研究

Clostridium perfringens can cause animal necrotic enteritis,human and livestock gas gangrene and food poisoning.Bacterial biofilm not only enable the bacteria to produce serious drug resistance,but also cause serious food safety.Biofilm formation of Clostridium perfringens is a complex interaction process with many genes, proteins and signal molecular.At present,researches on biofilm formation of Clostridium perfringens is limited for single gene or protein in domestic and abroad,there has not been reported on biofilm molecular mechanism of Clostridium perfringens from whole genes and whole bacterial proteins,which can not reveal systematically the biofilm molecular mechanism of Clostridium perfringens.Therefore,on the basis of previous studies,this project will use CLSM, SEM methods to determine biofilm morphology and structure of different growth stages of Clostridium perfringens in Qinghai and its correlation with the drug resistance.Using the gene difference comparison and the whole bacterial protein difference comparison research biofilm and floating type strain of Clostridium perfringens,obtain relevant gene and protein of biofilm formatoin,bioinformatics and mass spectrometry analyze genes' and proteines' species,structure and function of biofilm formation,reveal fully the molecular mechanism of bacterial biofilm,this will lay the foundation for studying further biofilm gene and molecular mechanisms of signal regulation for biofilm of Clostridium perfringens,can also provide a scientific basis for research and development of new antibacterial drug.

产气荚膜梭菌能引起动物坏死性肠炎、人畜气性坏疽和食物中毒。生物被膜不仅使细菌产生严重耐药，还能引起严重的食品安全问题。产气荚膜梭菌生物被膜形成过程是多基因、多蛋白与多信号分子共同作用的复杂过程。目前国内外关于产气荚膜梭菌生物被膜形成的研究工作仅局限于单一基因或蛋白，未见从全基因和全菌蛋白角度对该菌生物被膜分子机制进行研究的报道，这就不能系统地揭示该菌生物被膜形成的分子机制。因此本项目将在前期基础之上采用CLSM、SEM等方法明确青海地区产气荚膜梭菌生物被膜不同生长时期的形态和结构及其与耐药相关性；采用全菌基因差异和全菌蛋白差异比较法对产气荚膜梭菌生物被膜型与浮游型菌株进行研究，获得生物被膜相关基因与蛋白，生物信息学与质谱法分析生物被膜相关基因与蛋白的种类、结构与功能，全面揭示该菌生物被膜分子机制，这将为进一步研究该菌生物被膜基因与信号分子调控机理奠定基础，还可为新型抗菌药物的研发提供依据。

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症和人畜创伤性气性坏疽和人类食物中毒的主要病原菌之一。细菌生物被膜是指细菌为适应外部生存环境而黏附于接触表面，分泌黏性基质将其自身包裹所形成的膜性结构。本项目通过结晶紫染色、SEM等方法鉴定不同生长阶段的产气荚膜梭菌生物被膜；采用转录组测序及iTraq技术对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行差异表达基因和差异表达蛋白分析，以期为产气荚膜梭菌的防治及新型抗菌药物的研发提供理论依据。. 本研究通过普通光学显微镜对产气荚膜梭菌进行观察，结果表明随着培养时间的延长载玻片表面附着的产气荚膜梭菌数目逐渐增多。扫描电镜观察发现48 h时形成成熟的生物被膜，结构致密。通过RNA-seq技术对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行转录组差异表达分析，结果表明，BF菌和浮游菌相比，共有1162个基因表达差异显著，其中413个基因显著上调，749个基因显著下调。选择13个差异基因进行实时荧光定量PCR验证，结果显示6个差异基因表达上调，7个差异基因表达下调，差异表达趋势与转录组测序结果一致。通过iTRAQ技术对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行差异蛋白质组学分析，结果表明BF菌与浮游菌表达差异显著的蛋白总数为153个，其中上调的蛋白有48个，下调的蛋白有105个。产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌转录组和蛋白质组关联分析结果显示，转录组和蛋白组共同鉴定到的差异表达基因（蛋白）有77个。mRNA-蛋白质一致表达上调的差异基因主要参与丙酮酸代谢和嘧啶代谢；mRNA-蛋白质一致表达下调的差异基因主要参与嘧啶代谢、淀粉与蔗糖代谢、碳代谢、硫胺素代谢。 生物被膜与药物相关性实验表明，盐酸四环素和氧氟沙星这两种抗生素对生物被膜的影响很小，说明生物被膜对其具有较强的耐药性。