产气荚膜梭菌α毒素分子结构与生物学功能定位的研究

α毒素是产气荚膜梭菌最主要致病因子，是一种依赖锌离子的单链多肽金属酶，具有磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性等，但α毒素生物学功能位于多肽的部位以及分子结构和生物学功能之间的关系尚不清楚。本项目拟构建α毒素氨基端、羧基端和对在α毒素生物学功能中起关键作用的氨基酸残基进行定点突变。在此基础上，一方面，将α毒素氨基端、羧基端、突变体分别与具有中和磷脂酶C活性和溶血活性的抗α毒素单抗孵育，进行孵育前后的生物学功能检测；另一方面，用圆二色谱仪和快速停留仪测定α毒素氨基端、羧基端、突变体的二级结构和快速折叠动力学，并与α毒素本身结构进行比较，观察结构变化对其生物学功能的影响；最后利用核磁共振技术和ICP光谱技术，确定锌离子和α毒素酶活性中心的作用位点。通过上述研究，阐明α毒素生物学功能定位在单链多肽的部位及其分子结构和生物学功能的关系，为进一步研究α毒素分子作用机制提供理论依据。

α毒素(CPA)是A型产气荚膜梭菌主要致病因子，是引起人畜创伤性气性坏疽和人类食物中毒的主要病原菌之一。CPA是一种多功能性金属酶，具有磷脂酶C(PLC)和鞘磷脂酶(SMase)活性，但α毒素生物学功能位于多肽的部位以及分子结构和生物学功能之间的关系尚不清楚。本研究构建了α毒素N-端CPA1-250、C-端CPA251-370基因和α毒素第 68位组氨酸(CAT) 定点突变成甘氨酸(GGT)、第272位色氨酸(ACA) 定点突变成脯氨酸(CCG)突变基因，其表达量分别占菌体总蛋白相对含量的17.56%、16.43%、21.65%和18.34%。应用EXPASY服务器上的SOPMA法5种蛋白进行了2级结构预测和模拟了3D结构，结果CPA、CPA1-250、CPA-His68Gly和CPA-Thr272Pro突变体蛋白分子的2级结构主要是由α螺旋和无规则卷曲组成，CPA251-370蛋白主要是由β折叠和无规则卷曲组成。CPA1-250蛋白的3D结构与CPA的N-端部分相似，CPA251-370蛋白的3D结构与CPA的C-端部分相似。5种蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现其CD光谱比较相似。生物学活性实验结果表明，α毒素N-端CPA1-250保留了α毒素的磷脂酶C活性，但失去了α毒素的溶血活性；α毒素C-端CPA251-370、CPA-His68Gly和CPA-Thr272Pro突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性和溶血活性。免疫攻毒试验结果表明，用α毒素C-端CPA251-370蛋白、CPA-His68Gly和CPA-Thr272Pro突变体蛋白免疫的小鼠均可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1 α毒素攻击。本项目为进一步研究α毒素的分子作用机制奠定了坚实基础。