基因甲基化修饰在急性轻型卒中/TIA氯吡格雷抵抗中的作用及机制研究--基于CHANCE研究的亚组分析

Minor stroke and transient ischmic stroke (TIA) are the most common subtypes of cerebrovascular diseases. Our primary study, the multicenter randomized double-blind clinical trial "Clopidogrel in High-Risk Patients with Acute Nondisabling Cerebrovascular Events (CHANCE)", indicated patients with addition of clopidogrel even occurred stroke recurrence, suggesting clopidogrel resistance. CHANCE subanalysis showed glycated albumin predicted response to clopidogrel and our preliminary results found WFS1（rs10010131）was related with clopidogrel resistance. The recent result indicated association between DNA methylation and diabetes related to sustained hyperglycemia levels, and DNA methylation defines endocrine sensitivity in breast cancer. Therefore, we hypothesized that DNA methylation was related with clopidogrel resistance. In this project, we would perform a genome-wide methylation study in whole-blood DNA from the cohort of CHANCE trial. Illumina HumanMethylation450 BeadChip array was used to measure DNA methylation in CpG sites. New CpG sites and TXNIP（cg19693031）, which was suggested to be associated with diabetes, were replicated in two independent cohorts from CHANCE trial and PRINCE trial (Platelet reactivity in acute non-disabling cerebrovascular events). We would determine the role of stroke TOAST subtype in the effect of DNA methylation on stroke recurrence. Relationships of DNA methylation and glycated albumin, WFS1（rs10010131）, residual platelet reactivity would be analyzed. Thereafter, prediction model for clopidogrel resistance based on biomarkers and platelet activity would be built up by using ROC、reclassification methods and goodness of fit test.

我们前期CHANCE研究发现轻型卒中和TIA这两种最常见的脑血管病亚型患者存在氯吡格雷抵抗。亚组分析在蛋白水平发现糖化血清白蛋白能预测氯吡格雷抵抗，在基因水平发现血糖调节相关基因WFS1(rs10010131)和氯吡格雷抵抗相关，证明糖代谢参与氯吡格雷抵抗。新近研究发现基因甲基化修饰和糖尿病发生、卒中患者血糖水平控制有关。为揭露基因甲基化修饰在氯吡格雷抵抗中的作用，本课题拟利用CHANCE研究临床和生物样本库，通过人全基因组甲基化检测发现氯吡格雷抵抗相关的甲基化位点，在已有的CHANCE、PRINCE研究中验证新位点及和糖代谢相关的TXNIP(cg19693031)，寻找氯吡格雷抵抗甲基化位点；将甲基化、糖化血清白蛋白、WFS1(rs10010131)、残余血小板活性数据库对接整合，进行相关分析，揭露甲基化影响氯吡格雷抵抗的可能机制，最后建立基于生物标记物和血小板功能的氯吡格雷抵抗预测模型

我们前期研究表明血糖控制不佳和氯吡格雷抵抗有关。本项目进一步检测接受P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷或替格瑞洛的急性轻型卒中/TIA患者和糖代谢相关的甲基化位点，并采用Verify now方法检测不同时间点（7天和90天）和P2Y12受体相关的残余血小板活性，分析甲基化和血小板残余活性之间的相关性，没有发现和残余血小板活性相关的甲基化位点，但是SREBF1(cg11024682)、APOBEC3H(cg06229674)甲基化和7天血小板活性有相关趋势。在此基础上，分析了遗传因素对国人卒中的影响，发现是否具有卒中家族史患者临床特征有所区别。同时分析了8622例急性缺血性脑血管病患者相对应激高血糖（空腹血糖/HbA1c）与1年神经功能残疾和死亡之间的关系，发现应激高血糖是1年神经功能残疾或死亡的独立危险因素。并且在糖尿病或无糖尿病患者中应激高血糖都和1年神经功能残疾相关，而应激高血糖和死亡之间独立相关仅存在于非糖尿病患者。. 本课题还对3044名急性轻型卒中/TIA患者进行HCY检测，结果发现血同型半胱氨酸水平可预测女性患者对氯吡格雷药物的疗效，即在女性患者中，同型半胱氨酸水平升高的患者，氯吡格雷疗效不佳，而男性患者中不存在这样的交互作用。并且针对807例伴ICAS的急性轻型卒中/TIA的患者检测多种炎症蛋白标记物，发现hsCRP与ICAS患者氯吡格雷抵抗相关，而非ICAS患者无关，提示患者无hsCRP水平升高时接受氯吡格雷治疗效果更佳。此外，本课题针对急性缺血性脑血管病患者，进一步分析包括hsCRP在内的7种炎症蛋白，结果发现，IL-6,hsCRP和卒中复发有关，即使已经接受了抗血小板聚集等二级预防药物。同时，进一步分析发现，对于胆固醇已经达标的患者，即使已经接受了抗血小板聚集等二级预防药物，炎症残余风险仍然和卒中复发有关。. 研究结果不仅为筛选高危患者提供了可靠的实验室依据，为临床上实现抗血小板精准治疗提供重要依据，同时针对目前的研究热点，验证了炎症残余风险在卒中复发中的作用，为消除卒中复发残余炎症风险提供治疗风向标。