中国特有柑橘地方品种果实PMFs的组分鉴定及其单体的活性研究

Citrus fruits have been cultivated for more than 4000 years and many different local cultivars were found in China. Citrus polymethoxylated flavonoids (PMFs), a characteristic component of Citrus fruits, have many different biological activities, such as antioxidant, anti-inflammatory, regulating glucolipid metabolism, and prevention and treatment of various chronic diseases of human beings. For future study of citrus PMFs, evaluation of citrus fruits quality and use of the related germplasms，it is necessary for us to have a full understanding of the type and content variations of PMFs in different local cultivars. In this study, we will analyze systematically the types and content of Citrus PMFs using our new UPLC method on the basis of our studies on citrus flavonoids in the past years. First, we will analyze the type and content of PMFs in the fruits extracts of Chinese native citrus cultivars and search for the new PMF types; secondly, we will separate, purify the newly found PMFs types one by one using MS-Directed AutoPure System, and their chemical structures will be identified; finally，we will focus our study on the biological functions such as anti-oxidant, anti-inflammation and anti-aging activities of the PMFs extracts and their major monomers from different fruit types, study the relationships between structures and bioactivities of major monomers, and explore the underlying mechanism of citrus PMFs variations in different citrus fruits. This study will provide essential information for future health quality evaluation of citrus fruits by using flavonoids such as PMFs, and also has important practical implications for a full use of our Citrus fruits germplasm in China.

我国柑橘栽培历史悠久，拥有丰富的地方品种资源。 柑橘多甲氧基黄酮(PMFs)是柑橘果实特有的功能成分，具有与人体健康相关的多种生物活性。 弄清柑橘果实中PMFs的种类和含量变化，是研究柑橘属植物PMFs、未来柑橘果实品质评价及资源利用的基础。本项目拟利用新的柑橘PMFs超高效液相色谱分析方法，对柑橘属植物果实中PMFs的种类和含量首次进行全面系统的研究。 首先，利用UPLC-Q-TOF-MS/MS系统对果实提取物中PMFs的种类、含量进行系统分析，寻找未知PMFs成分；其次，借助新的质谱引导的自动纯化系统分离、纯化未知PMFs成分，鉴定其单体的结构；最后，重点评价不同PMFs提取物及其单体的生物活性，分析PMFs组成、含量和结构与生物活性的关系，研究柑橘PMFs生物活性的作用机理。 项目的研究对未来柑橘果实营养健康价值评价、对我国柑橘地方果品资源的利用有重要的科学和实践意义。

本项目圆满完成了预期目标。但在项目执行过程中，项目成员由于实际工作的需要，对部分方法进行了适当的改进。研究利用超高效液相色谱结合质谱引导的自动纯化系统对27个中国特有柑橘地方品种果实种多甲氧基黄酮（Polymethoxylatedflavovones, PMFs）进行分析、分离和纯化，并评价不同PMFs提取物及其单体的生物活性和作用机理。该项目取得的主要研究成果罗列如下：第一，收集了27份柑橘种质资源的果实，利用超声辅助对其果汁、果肉、果皮的PMFs提取。第二，建立了柑橘PMFs超高效液相色谱检测方法并分析了果实不同部位的18种主要类黄酮，包括6种黄烷酮，1种黄酮和11种PMFs含量和成分。结果表明，PMFs主要存在于柑橘皮中果皮中。在全部27份品种中PMFs总量最高的为6个宽皮柑橘品种：岩溪晚芦，粗皮狗屎柑，安江红橘，桂花蒂南丰，大红袍和汕头蕉柑；川陈皮素、橘皮素和甜橙黄酮三种PMFs单体在收集的柑橘果皮材料种广泛存在。第三，基于大孔树脂与质谱引导的半制备高效液相色谱联用的 PMFs 分离、纯化方法，分离纯化出 6 个PMFs单体：异橙黄酮、甜橙黄酮、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、橘皮素和 5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮并利用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 和核磁共振1H谱、13C 谱对其结构、纯度进行鉴定，结果表明得到的单体纯度均高于 95%。第四，对提取的柑橘PMFs提取物和单体的生物活性进行评价以探究不同PMFs组成、结构对生物活性的影响。研究包括化学法测定11种PMFs单体自由基清除能力和利用荧光素酶报告基因Nrf2系统评价27种PMFs提取物对细胞氧化应激水平的干预能力；评价27种PMFs提取物和5种单体缓解LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症表型能力；我们研究了27个提取物和5个单体对酵母 BY4742 时序性寿命（CLS）的影响。总体上，我们的研究对目前中国特有柑橘地方品种果实种PMFs的成分、含量及生物活性进行分析。与此同时，探究不同PMFs组成的混合物或单体生物结构-活性的不同，为下一步科学利用柑橘资源提供一定的基础。