细胞核内低氧诱导因子转录活性的调节机制研究

The regulation of angiogenesis by hypoxia is an important response in vivo to ischemic injure. Hypoxia inducible factor -1(HIF-1) is a key transcriptional factor to regulate angiogenic pathway. It is elusive that HIF-1 has high protein content and low transcriptional activity during chronic myocardial ischemia. Recent researchs show that the trace element copper regulate the transcriptional activity of HIF-1. However, the molecular mechanism of copper to regulate HIF-1 is still unclear. We found that copper content in nucleus is increased after hypoxia 24 hours, meanwhile a copper chaperon CCS ingress nucleus much more under hypoxia condition than under normoxia. Further experimental results showed that CCS regulated HIF-1 activity by inhibited FIH1. FIH 1 is a hydroxylase to forbide transcriptional complex formation of HIF-1 in nucleus. Element analysis showed that FIH1 interacted with copper binding proteins. Based on these scientific findings, our research work will focus on three aspect: (1) What are the molecular basis of CCS affecting FIH 1? (2)In addition to CCS, is there another copper binding protein involved in these processes? (3) How the copper binding protein regulates FIH1? Our research work will provide new theoretical basis for clinical medication of HIF-1.

低氧诱导因子(HIF-1)是机体缺血缺氧时调节血管再生的核心因子。慢性心肌缺血组织中有HIF-1表达量上升但转录活性下降导致血管新生减少的矛盾现象。前期研究表明，HIF-1进入细胞核后铜有确保其活性的作用。进一步实验发现缺氧时细胞核中的铜含量增加，核内的超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白(CCS)含量也增加。以CCS为切入点我们发现它对HIF-1活性的调节是通过抑制核内天冬酰胺酰羟化酶(FIH1)实现的。FIH1是调控HIF-1转录复合物形成的关键分子，利用免疫共沉淀富集与FIH 1结合的蛋白复合体，经分析发现FIH 1与铜结合蛋白有相互作用。基于上述研究，本项目将围绕(1)CCS抑制FIH1的分子基础是什么(2)鉴定介导CCS与FIH1相互作用的关键铜结合蛋白(3)该蛋白对FIH1的调节机制是什么三个问题深入研究细胞核内HIF-1转录活性的调控机制，为临床上治疗心肌缺血提供新的作用靶点和理论依据。

低氧诱导因子（HIF-1）是机体应对低氧反应的核心因子，调节了下游超过100个基因。在慢性缺血状态下，心脏的HIF-1α含量仍然增高但转录活性下降。课题组前期研究已经证实在慢性缺血时心脏的低铜状态与HIF-1α转录活性下降之间有相关性。铜是HIF-1α进入细胞核后形成转录复合物的必需因素。由于机体内不存在游离的铜离子,本研究项目的重点就是探索铜调节HIF-1细胞核内转录活性的关键含铜蛋白和其调节HIF-1转录活性的机制。.我们确认了细胞核内与HIF-1α相互作用的FIH1是铜调节HIF-1转录活性的关键蛋白。以FIH 1 为抓手，采用免疫共沉淀富集了正常生理条件和缺铜状况下能与FIH1 结合的蛋白，并用质谱定性和非标定量的方法比较了两种情况下能和FIH1 结合蛋白的差异。通过氨基酸序列分析筛选出与FIH1结合并具有金属结合位点的候选因子，并选择 ABCE1开展研究。.首先采用IMAC-Cu结合小柱富集细胞内能与铜离子结合的蛋白，以已知的含铜蛋白CCS为参照，在体外验证了ABCE1与CCS一样具有结合铜离子的能力。采用重组纯化ABCE1蛋白通过ITC的方法确证ABCE1结合铜离子的强度。第二步我们采用转染带有GFP标记的ABCE1质粒，镜下观察ABCE1在细胞内的准确定位，以及分离细胞浆和细胞核经免疫印迹均确认ABCE1存在于细胞核中。由于没有关于ABCE1在细胞核中的功能的详细报道，我们沉默了ABCE1，观察HIF-1对下游不同基因的表达情况，发现在沉默ABCE1时，HIF-1调节的下游基因BNIP3，VEGF显著下降，而IGF2没有变化。这种对HIF-1转录活性的选择性调节与团队发现的铜对HIF-1转录活性的选择性调节一致。.本项目探索了在细胞核中参与调节HIF-1转录活性的潜在含铜蛋白，首次确认ABCE1具有铜离子结合特性，并发现该蛋白具有影响HIF-1转录活性的作用，并且这种作用与课题组已经确认的铜选择性调节HIF-1转录活性的特点一致性。该工作对深入理解HIF-1转录活性的选择性调节的分子机制提供了一个新的切入点。此外利用项目支撑，研究工作还扩展了细胞核中FIH1进入细胞核的机制以及含铜蛋白的蛋白组学分析方法。研究人员参加国际会议一次，发表会议论文1篇，投递SCI论文4篇，发表1篇，接收1篇，处于修改阶段2篇。