TRPC通道与血管构建和血管形成的相关性分析及其关键基因在非血管化游离输送盘牵张成骨过程中的生物功能研究

Transport Distraction Osteogenesis(TDO) technique has broad application prospects because of its many irreplaceable advantages in the field of cranial and maxillofacial surgery, but for those patients who has serious bone defects , bone deformities and can't use their bone segments ,TDO doesn't work. We put forward a new model of TDO that is Nonvascular Transport Distraction osteogenesis (NTDO) for the solution of this problem. On the basis of successful construction of NTDO animal models, in order to further elucidate the NTDO's mechanism ,we will employ the method of gene silencing to filtrate TPRC molecules, which can mostly facilitates EPCs proliferation, differentiation, migration and detect the location and expression of downstream target genes. We will transfect and import the filtrated TRPC molecules into the endothelial progenitor cells (EPCs) of bone marrow and make it overexpression on EPCs, and observe its effect in regulating angiogenesis. We will study the mechanisms of TRPC channels and its regulation of angiogenesis during NTDO. The study can further clarify new bone formation mechanism of NTDO and provides theoretical basis for NTDO's widely clinical application in treating all kinds of serious bone defects or bone deformities.

牵张成骨技术因其具有许多无可替代的优越性使其在颅颌面外科领域具有广阔的应用前景，但对严重的骨缺损、骨畸形且难以利用自身骨段制作输送盘的患者来说却难以奏效。我们提出"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式，NTDO"为这一问题的解决提供了可能。我们在成功构建并验证"NTDO"动物模型的基础上，为进一步阐明其机制，本课题组拟用基因沉默的方法筛选促进EPCs增殖、分化、迁移最有效的TPRC分子，并检测其下游靶向基因的定位及表达，之后，转染筛选出的TRPC分子将其导入骨髓内皮祖细胞，促使被筛选出的TRPC分子在EPCs中过表达，并观察其调控血管新生的作用。研究TRPC通道在"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"新骨形成时调节血管形成的机理，从而进一步阐明"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"新骨形成机制，为进一步在临床上广泛应用"非血管化游离输送盘牵张成骨新模式"治疗各种严重骨缺损或骨畸形提供理论依据。

目的.牵张成骨是将可控的机械力间断施加于断裂骨端，以增强再生过程并在牵张间隙中诱导新骨形成的技术。EPCs参与血管生成的过程受到促血管生成物质及抑制血管生成物质的调控。通过检测TRPC的mRNA和蛋白，发现在培养的的血管内皮细胞和完整的血管内皮中表达TRPC4是TRPC家族的重要成员。本实验应用EPC作为种子细胞，构建慢病毒载体介导的siRNA沉默TRPC4基因，筛选出沉默效果最佳的siRNA转染EPCs。研究TRPC信号转导通路在牵张区新生血管的相关分子调控过程，并且，利用高通量测序技术对牵张成骨区域等组织的miRNAs进行表达量聚类分析，发现miRNA-21、10、451、27b、486、205在牵张成骨区域及胚胎骨中具有共同表达。因此，我们推测上述miRNAs可能通过调控靶基因进而调控EPCs血管发生，从而促进新骨形成，为进一步阐明牵张成骨模式中的新生血管形成机制提供理论依据。.方法.1.犬内皮祖细胞（EPCs）体外分离培养及鉴定；2.慢病毒介导的TRPC4-siRNA转染EPCs；3.沉默TRPC4基因对EPCs生物学行为功能的影响；4.共培养体系下EPCs增殖和成管实验；5.共培养体系下EPCs细胞因子及TRPC通道的表达；6．筛选调控EPCs成血管分化的miRNAs及其生物信息学分析；7．EPCs在机械力刺激、成血管诱导下Wnt信号通路的差异性表达。.结果.1.免疫组化实验观察到TRPC4抗体阳性表达;2.TRPC4慢病毒载体EPCs感染MOI值为10;3.沉默TRPC4基因降低了EPCs的增殖、活化内皮迁移，活化内皮粘附、EPCs管样结构形成能力。TRPC信号下游信号分子VEGF和SDE-1的蛋白表达均降低；4.BMSC与EPC共培养条件下EPCs生长对数期较其余两组提前；5.共培养组VEGFA、b-FGF、TRPC1免疫组化结果呈阳性，对比其余两组差异有统计学意义；6.EPCs在成血管分化过程中，miR-486，205，21，27b与VEGF-A，bFGF有正相关性，具有显著统计学意义。.结论.1. 沉默TRPC4基因降低EPCs增值殖、黏附能力，并下调TRPC信号下游信号分子VEGF、SDF-1蛋白的表达，降低成血管功能；2.共培养体系增强EPCs的增殖能力及成管能力；3.miRNA可能通过抑制靶基因，进一步调控Wnt信号通路，达到促进血管生成目