两个钙结合蛋白基因在大白菜雄配子发育过程中的功能鉴定

The multiple allele inherited male sterile material in Chinese cabbage is not only an excellent germplasm in heterosis breeding，but also an ideal mutant resource for studing the male gametogenesis development in plants. In previous studies, the applicant analyzed the transcriptome differences between the fertile and sterile plants in the male sterile line "AB02" and found that two calcium-binding protein genes, BrCaBP1 and BrCaBP2, were strongly inhibited in the sterile plants. In this study, the temporal and spatial expression and subcellular localization of BrCaBP and BrCaBP2 will be analyzed by using in situ hybridization and GFP fusion expression.This study is aimed to silence the expression of BrCaBP1 and BrCaBP2 in Chinese cabbage and flowering Chinese Cabbage by RNAi,respectively,and then identify the fertility change in the transgenic progeny.The bud transcriptomes of transgenic progeny and wild type plants will be analyzed by the second generation sequencing techniques, and compared with the bud transcriptomes of "AB02" to discuss the probable mechanism of calcium signaling pathway in the fertility regulation of the multiple allele male sterility of Chinese cabbage.The foudings will be valuable for further understanding of mechanism of the male gametogenesis development in plants，and lay a theoretical foundation for better utilizing the multiple allele male sterile germplasm in Chinese cabbage.

大白菜复等位基因雄性不育资源既是杂种优势利用的优异不育种质，也是研究高等植物雄配子发育的理想突变体资源。在前期研究中，申请者分析了该系统雄性不育两用系"AB02"可育株和不育株的转录组差异，发现钙结合蛋白基因BrCaBP1和BrCaBP2在不育株上受到强烈抑制。本项目拟利用组织原位杂交和GFP融合基因表达研究BrCaBP1和BrCaBP2的时空表达模式及亚细胞定位；利用RNAi技术，分别抑制大白菜和菜心中BrCaBP1和BrCaBP2的转录，鉴定转基因植株后代的育性变化，同时利用第二代测序技术对转基因植株和野生型植株的的花蕾转录组进行深度测序，并同已有的"AB02"系统花蕾转录组测序数据相比较，探讨钙信号传导途径在大白菜复等位核不育系统育性调控中的可能作用机制。本项目成果对深入研究高等植物雄配子发育的内在调控机制具有重要意义，也将为大白菜复等位基因雄性不育资源的深入利用奠定理论基础。

众所周知，Ca2+是植物细胞中最重要的第二信使，钙结合蛋白是Ca2+信号的受体，但目前研究者对于钙结合蛋白在植物雄配子发育中的作用机理研究还比较少。本项目研究了BrCaBP1和BrCaBP2表达模式，利用RNAi技术验证其功能。启动子活性分析和组织原位杂交分析表明，两个钙结合蛋白基因只在花药中表达；RT-PCR分析表明，两钙结合蛋白基因在花粉中均表达；获得了两个基因的RNAi转基因植株，经PCR鉴定，分别获得5株BrCaBP1和7株BrCaBP2T0转基因阳性植株，M0均出现花粉和花药的败育现象，但雄蕊败育并不彻底，离体花粉萌发率只有30-45%。利用第二代测序技术对两用系中不育株（MsMs）和可育株(MsfMs)的花蕾转录组进行了深度测序，共得到1013个差异表达基因，与可育花蕾相比，其中106个在不育花蕾中上调表达，907个下调表达。发明了一种将小孢子培养技术与60Co-γ辐射诱变和EMS处理相结合，快速创制纯合突变体的方法，较之传统的突变体创制方法，通过培养诱变处理后的小孢子，可以在短时间内获得纯合突变体，是突变体创制上的新思路，共计得到11份确认的突变体。构建了基于渗透肽的大白菜小孢子遗传转化体系，其原理在于，借助渗透肽的携带作用，在游离小孢子加倍之前将外源基因导入目的基因组，借助培养过程中的加倍事件，在短时间内得到纯合的转基因植株。我们对新创制的1份细胞核雄性不育突变体研究发现，其不育性由单隐性基因控制，命名为ftms。经过多世代观察，显示该突变体的不育性败育彻底，无环境敏感性，除雄蕊育性外野生型和突变体其它性状无明显差别；细胞学检测表明其不育来自于绒毡层细胞的异常液泡化，目前将不育基因定位在A05染色体上，利用RNA-Seq技术对突变体和野生型的花蕾转录组进行比较分析，结果共检测到4,488个差异表达基因，其中，1,039个差异表达基因在突变体上调表达，3,449个基因下调表达。通过项目开展，发表科研论文1篇，投稿3篇，申请国家发明专利3项，备案蔬菜新品种2个，获辽宁省技术发明奖二等奖1项。