原卟啉原氧化酶突变体的性质研究与预测

农药靶酶对农药的抗性已经成为农业生产中一个值得关注的问题。开展农药靶标抗性的分子机制研究，建立抗性预测方法，对于设计开发抗性综合治理药物，以延长药物使用寿命，减缓抗性的发生以及实现农药抗性的早期预警都具有十分重要的意义。在本项目中，我们将除草剂靶酶原卟啉原氧化酶及突变体库的构建及酶学性质的研究、该酶及突变体与农药相互作用的研究、该酶突变体性质的预测方法研究三方面作为有机整体开展工作。深入探讨酶底物、农药分子与靶酶及突变体之间的相互作用规律及其结构基础。发展建立基于分子动力学模拟结果的统计表征的突变酶性质预测方法。这一方法预期可以预测农药靶酶突变体的酶学性质及对农药的抗性，综合评价靶酶突变体自然突变的影响。有望成为基于分子动力学模拟结果的统计表征的农药靶酶突变体酶学性质及抗性预测的普适方法。

广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO，EC 1.3.3.4)是一个具有重要农学和医学意义的生物靶标。其催化原卟啉原IX氧化为光敏物质原卟啉IX，是叶绿素和亚铁血红素相同生物合成途径中的最后一个酶。PPO酶被抑制或自身缺损，会导致原卟啉IX过度积累并在光照和氧气存在下，发生光动力学反应，最终导致细胞死亡。人体中PPO的异常是导致混合型卟啉症 (Variegated Porphyria，VP )的直接原因。医学上，PPO酶被用于光动力学方法治疗癌症；农业中，PPO酶是一类光敏型除草剂的重要标靶。因PPO非植物所特有，考虑到人畜及环境安全，种属选择性是针对该靶标设计、开发除草剂的关键问题。而除草剂抗性的出现，使除草剂开发之初综合考虑抗性规避成为必然。.靶标特异性为实现药物特异性提供了基础。本质上，种属选择性药物及抗性规避药物的设计开发，均依赖于对我们对一组靶酶（源于不同种属或若干突变体）性质规律性的认识及在此基础上预测方法的建立。.本项目综合运用分子生物学、生物化学、结构生物学、计算化学等技术，开展了多种属PPO酶及突变体库的构建及酶学性质研究，完成近80个种属PPO酶序列的全基因合成， 10个种属PPO酶的表达、纯化及酶学性质（Km、kcat、Kc等）研究，3个种属、近50个PPO酶突变体基因重组表达体系的构建。培养及解析了PPO酶及其突变体与其抑制剂复合物晶体结构4个。完成三个代表性种属（人、烟草、枯草芽孢杆菌）PPO酶底物结合模式的研究，为种属选择性抑制剂设计提供了结构基础。完成不同种属PPO酶及近百个突变体的分子动力学模拟研究，阐释了酶活性的动态结构机制。通过对体系平衡态构象集的统计分布研究，提出优势构象群（Privileged conformation）概念，发现优势构象群的概率决定靶酶活性，据此建立了PPO酶活性定量预测方法（Prenzyme）。通过进一步对酶功能核心区域氨基酸功能研究，提出：氨基酸作用网络的动态平衡，影响优势构象群概率，进而影响蛋白功能的“动态调控机制”（ "Dynamics regulates Kinetics" Hypothesis）。