BMP4/7启动肌纤维细胞去分化促进肌肉再生的分子机理研究

Among the adult vertebrates, the salamanders (newt) have the widest repertoire of regenerative abilities, which mainly attribute to the capability of reprogramming of the differentiated cells naturally. One such example is the de-differentiation of myofibers into regenerative progenitors during limb regeneration. We have recently found that the circulating Bone Morphogenetic Proteins (BMP4/7) could be activated by thrombin during injury to initiate the de-differentiation of newt but not mice myofibers. In order to understand how the BMP signaling is regulated in myofibers of different species, we will (1) identify the core components of BMP signaling during newt myofiber de-differentiation by gene editing and Brainbow lineage tracing techniques. (2) Define the molecular and cellular basis of failed myofiber de-differentiation in mammals. (3) Stimulate the myofiber de-differentiation and facilitate skeletal muscle regeneration in mice by mimic the newt genetic program. The project will not only unravel the mystery of the diminished spontaneous reprogramming potential in mammals during evolution, but also develop novel and effective cell therapies to combat satellite cell dysfunction and improve skeletal muscle healing and regeneration.

两栖类蝾螈的肌纤维具有特殊的细胞去分化能力，是研究肌肉再生的理想模型。申请人研究发现血清中的BMP4/7二聚体在肢体损伤后被凝血酶激活，启动蝾螈的肌纤维细胞发生去分化以促进肌肉再生，而活化的BMP4/7却无法去分化小鼠的肌纤维细胞。据此我们推测：BMP通路在不同物种间的特异性调控使哺乳动物肌纤维失去了去分化能力。本项目拟（1）筛选并验证BMP通路在蝾螈肌纤维细胞去分化过程中的关键基因，（2）分析BMP通路的关键基因在蝾螈和小鼠的肌纤维细胞中的表达和功能差异，阐明哺乳动物肌纤维细胞无法去分化的分子机理，（3）利用基因修饰小鼠模拟蝾螈基因表达，诱导哺乳动物肌纤维细胞去分化以促进肌肉再生。本项目将揭示BMP诱导肌纤维细胞去分化的具体作用机理，为促进肌肉再生和治疗肌营养不良等肌肉疾病提供新的途径和靶点。

两栖类蝾螈 (newt)的肌纤维细胞具有特殊的去分化能力。自然条件下，哺乳动物的肌纤维细胞，无法进行去分化过程。哺乳动物的肌肉再生由肌肉干细胞提供细胞来源，且肌肉干细胞随着机体的疾病、衰老不断损耗。在newt肢体再生过程中，其肌纤维细胞会经历片段化、增殖以及再分化，参与肌肉再生的过程。肌纤维细胞在动物肌肉组织内广泛存在，是肌肉再生潜在的细胞来源。因而，newt可作为研究肌肉发育与再生的理想模型。本研究通过研究BMP信号通路、调控肌肉发育的关键转录因子（pax3、pax7、myoD、myf-5）以及能量代谢等方面，解析了蝾螈独特的肌肉发育和再生的特点，为解析蝾螈肌纤维细胞去分化的分子机制奠定了基础。申请人系统性的在蝾螈的基因组和转录组数据检索一系列和肌肉发育再生相关的信号通路和转录因子，包括BMP2/4/7、pax3、pax7、myoD、myf-5等，发现在蝾螈中只存在BMP2、pax3、pax7、myf-5。申请人使用CRISPR-Cas9技术，分别构建了BMP2、pax3、pax7、myf-5敲除动物。研究发现：（1）BMP2在蝾螈的生长发育中发挥着重要作用，杂合子胚胎表现为畸形，且难以存活；（2）pax7敲除不会显著影响蝾螈的生长发育和肌肉再生；（3）pax3在蝾螈的肌肉发育中发挥着重要的作用，pax3敲除会导致蝾螈部分肢体出现肌肉缺失，但肌肉缺失不影响蝾螈的肢体再生；（4）蝾螈在进化过程中丢失了myoD，在蝾螈中敲除myf-5可达到在其它物种中同时敲除myoD和myf-5的表型（背部肌肉缺失）。以上研究表明：（1）myoD以及BMP2可能在蝾螈肌纤维细胞独特的去分化能力中发挥着重要的作用。蝾螈在进化中丢失了myoD这个促进肌源性细胞分化的基因，肌纤维细胞可能处于一种未成熟的状态，因而蝾螈的肌纤维细胞拥有较强的细胞可塑性；（2）胎牛血清中bmp2/4/7可促进newt A1体外分化的肌管，重新进行DNA复制。而我们在蝾螈中只发现了BMP2，蝾螈的BMP2可能替代胎牛血清中的bmp2/4/7促进肌纤维细胞重新进入细胞周期。以上研究结果，对我们解析不同物种间肌纤维分化和去分化的分子机理提供了依据，为设计促进肌肉损伤修复治疗提供了新的方案。