丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶介导猪链球菌2型致病性的分子基础

Streptococcus suis type 2 (SS2) is one of the important zoonotic pathogens causing serious infections in pigs and human being. Earlier research focused on identification of virulence factors involved in SS2 pathogenicity. Few studies have been conducted on the regulatory aspects of virulence gene expression in relation to pathogenicity. There is paucity of information on the regulatory mechanisms of virulence factors by post-translational modifications such as phosphorylation. This proposal is planned to use site-directed gene deletion, phosphoproteomics and infection biology approaches, attempted to make a comprehensive analysis on protein samples from the mutants Δstk and Δstp, and their parent strain by 2D-PAGE and LC-MS/MS identification, and to obtain the phosphorylation profiles of SS2 proteins by serine/threonine kinase and phosphatase. Particular attention will be paid to the phosphorylation modification of virulence-related factors and those related to regulatory aspects of the expression of virulence-related genes. In vitro and in vivo pathogenicity-related tests will be conducted in combination with the knock-out mutants of particular genes to decipher the molecular mechanisms of phosphorylation on SS2 pathogenicity. The results would be of use of Ser/Thr phosphorylation as targets for developing novel antimicrobial drugs.

猪链球菌2型是重要的人畜共患病原，引起猪和人的重症感染。对其毒力因子的研究较多，但毒力基因表达调控和致病机制研究较少，特别是磷酸化等翻译后修饰对细菌毒力因子表达调控及其致病性影响方面鲜见研究。本课题拟综合应用基因定点缺失、磷蛋白组学、感染生物学等技术，通过对猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶编码基因缺失株Δstk、Δstp及其亲本株蛋白样品的2D-PAGE和差异磷蛋白质谱鉴定，系统探索该菌的磷酸化修饰底物谱，特别是代表性毒力相关蛋白和调控毒力基因表达的蛋白的磷酸化修饰，结合特定基因缺失和体内外致病性相关试验，解明Stk/Stp介导的磷酸化修饰在猪链球菌毒力因子表达调控以及由此引起致病性变化的分子基础，有可能为建立链球菌属细菌Stk/Stp为靶点的新型抗菌药物筛选提供理论和实验依据。

猪链球菌2型是重要的人畜共患病原，引起猪和人的脑膜炎、败血症等。对其毒力因子的研究较多，但对磷酸化修饰对细菌毒力因子表达调控及其致病性影响方面鲜见研究。本课题通过对猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶编码基因（stk和stp1）缺失株及其亲本株蛋白样品的差异磷蛋白质谱鉴定，系统探索该菌的磷酸化修饰底物谱，以及代表性底物蛋白磷酸化修饰与致病性的关系。stk和stp1基因缺失后对宿主细胞的黏附力增强，但对细胞的侵袭力和对小鼠的致病力显著下降，证明这两个基因与致病性有关。Stp2磷酸酶活高于Stp1，但Stp1对猪链球菌2型的致病力贡献显著大于Stp2，可能与Stp2蛋白表达水平低有关。stk和stp1基因缺失株的差异修饰蛋白114个（133个位点），其中绝大部分（88%，100/114）；Stk和Stp1可能的共调控蛋白6个。Stk可被Stp1去磷酸化，细菌分裂相关蛋白DivIVA和RNA结合蛋白均可被Stk磷酸化，同时可以被Stp1去磷酸化，证明两者为Stk和Stp1的共同底物。本研究首次同时探索stk和stp1基因缺失条件下猪链球菌2型强毒株的磷蛋白谱，发现Stk的磷酸化修饰底物谱显著广于磷酸酶Stp1的底物谱，且stk基因缺失株对小鼠无致病性，为以激酶作为抗菌药物靶标提供了理论依据。我们还首次证明RNA结合蛋白和DivIVA是Stk和Stp1的共修饰底物，分别以stk和stp1基因缺失株为背景构建双缺失株，系统研究这两个蛋白磷酸化水平对猪链球菌的生理和致病性影响，将为深入理解原核生物体内蛋白的磷酸化修饰对细菌致病性的调控机制提供重要依据。