脱落酸受体样蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)在玉米脱落酸介导信号转导中的作用

课题组在前一国家自然科学基金项目资助下，克隆了玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP2C）基因ZmPP2Ca，证明其在干旱胁迫下下调表达。新近在拟南芥上发现了脱落酸受体样蛋白PYL，与脱落酸结合引发构型变化，阻止底物蛋白进入PP2C活性中心，抑制其蛋白磷酸酶活性。本项目计划同源克隆玉米PYL蛋白基因开放阅读框，原核表达纯化PYL和PP2C蛋白；结合运用圆二色谱、三维核磁共振、生物信息学等方法，分析PYL和PP2C蛋白的空间结构关系，用酵母双杂交法证明二者相互作用关系；结合运用实时荧光定量PCR、Northern杂交、酶联免疫吸附和底物抑制分光光度法，研究耐旱性不同玉米自交系在干旱胁迫条件下，内源脱落酸积累与PYL蛋白基因表达和PP2C酶活性的关系；探明PYL蛋白和PP2C酶在玉米脱落酸介导信号转导中的作用，为玉米耐旱等抗逆性的改良提供理论依据。

课题组在前一国家自然科学基金项目资助下，克隆了玉米丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP2C）基因ZmPP2Ca，证明其在干旱胁迫下下调表达。2009年在拟南芥上发现了脱落酸受体样蛋白PYL，与脱落酸结合引发构型变化，阻止底物蛋白进入PP2C活性中心，抑制其蛋白磷酸酶活性。本研究结合生物信息学方法、酵母双杂交实验、双分子荧光互补等实验，从玉米基因组数据库中同源搜索、筛选到ABA受体样蛋白PYL共13个成员，分属3个亚家族，ZmPYL9-ZmPYL13为Ⅰ亚家族，ZmPYL4-ZmPYL8属于Ⅱ亚家族，ZmPYL1-ZmPYL3属于Ⅲ亚家族；PYL下游蛋白PP2C家族成员130个，分属16个亚家族，其中A亚家族有16个成员，与ABA信号途径密切相关。从玉米B73 cDNA中克隆得到ZmPYL基因12个完整序列，分别命名为ZmPYL1-12；ZmPP2C基因16个完整序列，命名为ZmPP2C1-16，这些基因在10条染色体上随机分布。没有染色体偏好性。其中A亚家族3个分别是ZmPP2C12, ZmPP2C14和 ZmPP2C16。酵母双杂交实验表明PP2C的A亚家族更强烈地受到ABA诱导，与PYL互作强烈，显示蓝斑。β-半乳糖苷酶的活性测定，也印证了上述结果。用玉米原生质体为材料，对有蓝斑反应的组合ZmPYL3-ZmPP2C16进行双分子荧光互补实验，表明在玉米体内ZmPYL3-ZmPP2C16在ABA 诱导下有强烈的互作关系。上述研究结果进一步表明，PP2C确实参与了ABA信号途径，可能与ABA诱导的抗逆性有密切关系，为深入理解玉米抗逆性分子机理以及改良抗逆性奠定了基础。