Apelin-一个新的调控干细胞定向心肌分化的关键因子调控作用与机制研究

Apelin及其受体APJ在胚胎原肠胚期就有表达，删除其基因使ESC不能向心肌细胞(CMC)分化,推测apelin是调控CMC分化的关键因子。申请人在国际上首次证实了BMSCs向CMC分化中有apelin/APJ表达。进一步拟在华通胶源间充质干细胞(WJ-MSC)及人胚胎干细胞(ESC)上，研究丢失及恢复apelin分子的干细胞向CMC分化潜能变化，及与心脏特异转录因子、关键信号因子表达的相关性，从而找出apelin启动与介导的关键转录因子及信号通路; 进而在丢失apelin分子的WJ-MSC及ESC上，及小鼠AMI模型上，给予不同浓度apelin-36，证实apelin蛋白可重新诱导干细胞向CMC分化及动员内源心肌源干细胞(c-kit+)增殖。确证apelin对干细胞定向CMC分化的调控作用，在分子细胞整体的整合上揭示其调控机制，为干细胞定向CMC分化诱导提供关键调控因子-apelin。

本研究目的为探索Apelin对心肌细胞定向分化调控作用与机制。① 体外细胞水平, 在脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)诱导向心肌细胞分化的模型上，通过过表达apelin基因或干扰apelin基因表达，覌察WJMSCs向心肌血管分化的生物学特征及效应机制。② 在体内大鼠心肌梗死模型上，覌察apelin-13在修复心肌改善心功能整体效应及作用机制。研究发现：①应用慢病毒载体携带apelin基因或Apelin-siRNA均可高效转染WJMSCs，过表达的apelin-WJMSCs在FGF及5-氮胞甘诱导下，可高效分化为表达心肌细胞特异标志TnT，MHC，α-actin, connexin-43的心肌样细胞。干扰apelin表达，Apelin-siRNA-WJMSCs仅少数细胞极低水平表达上述心肌细胞标志蛋白。然而，再外源补充apelin-13时，Apelin-siRNA-WJMSC又重新向心肌细胞分化。同样，在体外加入apelin-13，WJMSCs不仅大量向内皮细胞分化，而且形成了肉眼可见血管网结构。证明apelin是参与心血管早期分化的重要调控因子; ②机制研究中发现，在过表达apelin-WJMSCs向心肌细胞分化中，心肌细胞分化特异转录因子Mesp-1, Nkx2.5, Mef2c表达水平与apelin呈显著正相关。而Apelin-siRNA-WJMSCs分化中上述转录因子明显下调。③在体内研究大鼠急性心肌梗死模型上，当外源注入apelin-13，心肌梗死范围明显缩小，免疫荧光染色在心肌梗死带及梗死边缘带可见c-kit+/ Sca-1+/ flk-1+的心肌前体细胞生长，且与代表细胞有丝分裂标志Ki67共表达，与RT-PCR及Wersten blot检测呈現一致性增高。apelin-13有效的预防了心室重构，显著改善了心功能。因此, 本研究在体内外，在整体、组织、细胞、分子、蛋白水平，首次证实了apelin通过调控心脏早期发育的特异转录因子Mesp-1, Nkx2.5, Mef2c的转录与表达，介导了WJMSCs向心肌血管分化，及体内对心脏前体细胞的动员。因此，本研究在理论上，证实了apelin是一个调控心肌细胞定向分化的关键生物因子，在临床上，为心脏再生医学治疗提供了新的分子靶点。