家蚕丝腺特异性转录因子FMBP-1的结构和功能研究

The silk gland is the most efficient protein synthesis system among all kingdoms of life. The extremely efficient expression of silk proteins is finely regulated by a group of DNA binding proteins. Among them, the fibroin modulator binding protein-1 (FMBP-1) is specifically expressed in silk gland at the fifth instar, exhibiting a very strict stage- and tissue-specificity. Our previous results showed that FMBP-1 is a novel DNA binding protein, which recognizes the major groove of 4-bp DNA through its the score and three amino acid peptide repeat (STPR). However, the recognition mechanism between STPR and DNA still remains unknown. In addition, sequence analyses showed that STPR-containing proteins are also widely distributed in plants, animals and humans, indicating this DNA binding pattern is evolutionarily conserved. To comprehensively understand the fine molecular mechanism of transcriptional regulation of silk production, we will systematically study the functions of FMBP-1 and its related complexes in vitro and in vivo, using the methods of molecular biology, structural biology, biochemistry and cell biology, supplemented by bioinformatics analysis. The findings will provide molecular insights into the high efficiency of silk biosynthesis, and might guide the improvement of silk production in the future.

家蚕丝腺是迄今为止所有生物中最高效的蛋白质表达系统。丝蛋白基因的高效表达涉及很多DNA结合蛋白, 其中转录因子FMBP-1在五龄丝腺中严格地时空特异性表达。我们的前期工作表明，FMBP-1是一个完全新颖的DNA结合蛋白，通过高度保守的23肽重复区域（STPR）识别四碱基DNA序列的大沟。尽管已有关于STPR与DNA的研究报道，但是它们之间的识别机制到目前为止仍然未知。序列分析显示包含STPR的蛋白广泛存在于植物、动物和人类中，表明该DNA结合模式在进化上的高度保守性。我们将整合分子生物学、结构生物学、生物化学和细胞生物学方法，并辅以生物信息学分析，在体内、体外全方位研究FMBP-1及其可能复合物介导家蚕丝蛋白转录调控的精细分子机制。该项目将有助于我们深入理解家蚕丝蛋白高效表达的分子机制，并可能为提高蚕丝产量提供理论指导。

家蚕表达分泌蚕丝的丝腺是迄今为止在自然界中发现的最高效的蛋白表达体系，在众多参与蚕丝表达调控的DNA结合蛋白中，FMBP-1不但能识别蚕丝蛋白重链的基因上游区域-130位点及内含子区域+220、+290位点，且它的活性与重链基因的表达分泌具有严格的时间和组织相关性，被认为是调控重链表达的重要因子。FMBP-1中含有一个DNA结合结构域，该结构域由4个高度保守的23肽重复单元串联组成，简称BmSTPR。虽然这4个重复单元的核磁结构已经分别被解析，但是BmSTPR全长以及与DNA相互作用的整体结构并不清楚。我们利用解析了BmSTPR与三个不同长度靶DNA的复合物晶体结构，显示BmSTPR以连续α螺旋的方式沿着DNA的大沟延伸，形成锯齿状结构，每个重复单元对应4-bpDNA序列，参与识别的氨基酸残基非常保守且表现出周期性的相互作用，是一种新型的DNA结合模式。进一步的生化实验揭示BmSTPR对富含AT的DNA序列有较高的偏好性，并主要通过形貌特异性而非碱基特异性识别DNA，富含AT的DNA序列自身具有较高柔性和较宽大沟的特性可能是BmSTPR特异性识别的结构基础。多序列比对显示含有这种新型DNA结合结构域的蛋白广泛存在于动物界中，暗示着它们可能具有保守而重要的生物学功能。为了揭示高保守性STPR的可能功能，我们选取人源同源蛋白ZNF821作了系列细胞学实验，发现：hSTPR具有与DNA结合能力，能帮助ZNF821定位在细胞核中；hSTPR区域内有两段核定位序列；ZNF821与染色质的结合具有细胞周期依赖性；ZNF821具有结合组蛋白的能力，并呈梯度结合模式。同时发现将ZNF821基因敲低后，HeLa停滞在有丝分裂间期S期的细胞比例增大，暗示着该蛋白可能会影响DNA复制。基于以上结果，推测ZNF821的功能可能与染色质结构相关。