blaKLUC型β-内酰胺类抗生素耐药基因的传播机制及分子流行病学研究

The widespread CTX-M type ESBL has been one of the most concerns associated with extensive resistance of gram-negative bacteria to β-lactam antibiotics in the last two decades. KLUC, a recently identified CTX-M family member, was reported two times previously. Recent study demonstrated that more and more bacteria in Enterobacteriaceae contained this ESBL locating either on chromosome or on plasmid. The molecular mechanism for its mobilization between chromosome and plasmid is still unclear. We have obtained a total of 11 bacterial strains harboring this ESBL encoding genes which come from three different bacterial genus, including E. coli, E. cloacae and K. pneumonia. In this study, vectors which carried this gene will be sequenced. The transposable elements which are responsible for blaKLUC mobilization will be identified through comparative genomic analysis or ab initio prediction methods and the integrated site for blaKLUC will be verified. Furthermore, site-directed mutagenesis for this gene will be performed to analyze the core domain of the enzyme. In addition, a nation-wide screen of blaCTX-M family members against Enterobacteriaceae in five different districts will be conducted. The genes that derive from what kind of bacterial species and which strains will be further tracked. These results will reveal the differences of endemic trends among blaCTX-M family members and give an insight into the extensive emergency probability of blaKLUC gene.

CTX-M酶作为近二十年世界范围内最为关注的广谱β-内酰胺酶，它的快速传播造成了革兰氏阴性细菌对β-内酰胺类抗生素的广泛耐药。KLUC型ESBL作为最新发现的CTX-M家族成员，此前仅有两次报道，尚未引起广泛关注。最近的研究表明，越来越多的肠杆菌科细菌携带该酶的编码基因，且在染色体和质粒上均有发现，其传播机制尚不清楚。本实验室已获得三种细菌种属的共计11株携带blaKLUC细菌样本。本研究拟对上述细菌样本所承载该基因的载体进行测序，通过比较基因组学分析或从头预测，鉴定出介导blaKLUC移动的转座元件并进一步鉴定该基因的整合位点。其次，通过定点诱变结合酶活性测定的方法对该酶的酶活性区域进行鉴定，并将对全国不同地区不同年份的肠杆菌科细菌进行blaCTX-M家族各成员的检测，分析该家族各成员在各地区的流行趋势及差异。研究结果将对肠杆菌科细菌的β-内酰胺类药物耐药性治理及预防起到一定的指导作用。

在革兰氏阴性细菌中，广谱β-内酰胺酶是造成细菌对β-内酰胺类药物产生广泛抗性的根本原因。自1988年Matsumoto在日本发现并报道了第一个blaCTX-M型耐药基因以来，该ESBL在世界各国广泛被报道，并成为革兰氏阴性细菌耐药的新议题。由于该基因家族成员对第三代头孢菌素-头孢噻肟耐药，故而得名(CTX-M)。本项国家自然科学基金项目对近年来最新出现的CTX-M家族成员——KLUC酶，在新突变体筛选鉴定、酶活性位点、酶动力学参数、传播机制及分子流行病学开展了较为系统的研究，并得到了系列结果。. 截至目前各国共报道了5个KLUC突变体。其中，KLUC-3、4、5均由本实验室发现。此前的研究结果显示，KLUC-3与KLUC-1相似，对第三代头孢菌素如头孢噻肟具有很强的水解活性，而KLUC-4由于164位的Arginine突变为Leucine导致对β-内酰胺类药物无活性。KLUC-5相比KLUC-1和KLUC-3均只有一个氨基酸的变化，但对药物的水解活性却大幅度降低，主要表现为对oxyimino-cephalosporins，如头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松的水解活性的显著下降，且这些突变体的耐药活性均通过正反向的定点诱变和药物敏感性测试加以证实。同时，突变体KLUC-3的酶动力学参数也通过蛋白质诱导表达纯化、紫外分光光度法等系列实验进行了测定。. 对KLUC的两个突变体所在遗传载体进行测序表明，blaKLUC-3和blaKLUC-5分别位于23kb和182kb的质粒上，其基因环境为ΔISEcp1-InsB-InsA-TnpA-blaKLUC-3和ISEcp1-blaKLUC-5，表明blaKLUC-3和blaKLUC-5的移动均与ISEcp1元件相关，与大多数的CTX-M家族成员如blaCTX-M-3，blaCTX-M-15，blaCTX-M-62一致。克隆ISEcp1-blaKLUC-5至低拷贝载体pACYC184中，通过质粒消除和抗生素压力等的诱导，发现blaKLUC-5基因的低频率转移现象(<3.8×10-8)。