miR159介导的GAMYB转录因子表达对大岩桐花期调控的研究

miRNA研究表明许多植物miRNAs调控的靶标为转录因子基因，是分生组织同一性、细胞分裂、器官分离等所必需的，并参与开花基因表达调控。在短日照条件下，营养组织向花转换过程中主要是由赤霉素（GA）激活GAMYB转录因子表达，再进一步激活花分生组织特异基因LEAFY的表达所促发的。在该GA信号途径中，miR159通过直接降解GAMYB相关蛋白的mRNA，导致LEAFY基因转录水平的下降，从而延迟短日照下植物的花期。与转录抑制因子相比，miRNA能在转录后水平更迅速地调节靶蛋白含量，精确维持靶蛋白的稳定状态。基于我们对大岩桐开花相关基因的克隆和转基因功能研究的基础上，本申请拟在大岩桐中开展miR159家族不同成员基因和靶基因GAMYB之间的共表达以及降解作用的研究，探讨GA途径中miR159介导的GAMYB转录因子表达水平对大岩桐开花时间的调控作用，建立花期控制的观赏性花卉分子遗传新策略。

迄今，针对非模式植物，特别是花卉植物中miRNA调控花发育的研究很少。本项目以观赏性花卉大岩桐为材料，认真进行了miR159对成花途径中关键靶基因的调控作用及其机理分析研究，顺利完成了预定研究计划，达到了预定目标。获得主要结果有：1，GAMYB基因全序列的克隆及miR159剪切位点的验证，发现SsGAMYB基因的964～985 bp区域的第11位碱基是miR159的直接剪切位点，证实该基因是miR159的靶基因。2，利用农杆菌介导法获得高表达和抑制表达miR159转基因大岩桐株系。3，在短日照条件下，大岩桐35S:miR159a过表达株系花期延迟37（± 4.93）天，而35S:MIM159转基因株系花期提前20（± 3.5）天。定量RT-PCR检测进一步说明改变miR159的表达水平可以调控靶基因GAMYB的表达，从而提前或延迟大岩桐的开花时间。4，利用qRT-PCR的方法检测转基因株系中GAMYB下游基因的表达变化。发现miR159介导的GAMYB表达调控了成花关键基因LFY的表达水平，并进一步调控下游MADS-box基因的表达。说明35S:miR159a和35S:MIM159转基因株系花期的变化很大程度上与LFY基因表达水平相关。5，LFY基因异常表达引起大岩桐花器官形态的变化 35S:MIM159转基因株系中，高表达LFY基因的株系出现了萼片和花瓣的相互转化，即萼片花瓣化以及花瓣萼片化。qRT-PCR分析结果表明萼片和花瓣的相互转化可能与第一轮和第二轮花器官中SsAP1和SsAP3异常表达相关。.综上所述，本研究表明在短日照条件下通过转基因改变miR159的表达可以有效的调控靶基因GAMYB以及下游成花关键基因LFY的表达水平，进而显著提前或延迟了大岩桐的开花时间。说明调控开花相关miRNA的表达水平可以改变大岩桐的花发育进程。基于植物miRNA序列的高度保守性，通过转基因的方法调控开花相关miRNA表达将为观赏性花卉的花发育和花期控制提供一条分子遗传育种的新途径。已发表SCI论文4篇，核心期刊论文1篇，申请专利1项。培养博士生2名，硕士生3名。