大岩桐叶序调控相关基因的克隆及功能分析

Phyllotaxis, the regular arrangement of leaves and flowers around the stem, is a key feature of plant architecture. Now, the widely accepted mechanism of phyllotaxis is based on the positive feedback loop between plant growth hormone auxin and its efflux transporter PIN-FORMED1 (PIN1). The model addresses the maintenance of phyllotactic pattern. However, it could not elucidate how phyllotactic patterns are generated de novo, and how they change under natural conditions. That was partly due to the irregular phyllotaxis and pleiotropic phenotypes of the most phyllotactic mutants. In the previous work, we screened the tricussate whorled phyllotaxis (twp) mutant in gloxinia (Sinningia speciosa) from somatic mutation. The phyllotaxis of the mutant reverted from decussate to tricussate and showed no any other morphological alterations. In this study, suppressive subtraction hybridization (SSH) was used to identify differentially expressed genes from the above twp mutant and wild type gloxinia. The cDNA fragments derived from SSH library were screened and verified via T/A cloning and reverse Northern blot. Then the positive clones were randomly selected for sequencing and BLAST analysis. After that, the full-length cDNA of the differentially expressed genes was obtained via RACE (rapid amplification of cDNA ends). To determine the functions of the differentially expressed gene further, spatio-temporal expression pattern of the gene in twp mutant and wild type, RNAi and overexpression of the gene in wild type, twp mutant and pin1 mutant complementation analysis were performed. These studies would enhance our understanding on the mechanisms of the initiation, maintenance and transitions of phyllotaxis.

植物叶序的形成可以追溯到叶原基在SAM的形成与排列方式，并受到生长素浓度及其极性运输的调控。该机制解释了SAM中新叶原基的产生位点和固有叶序的维持。但我们对于全新叶序如何从头形成或者两种叶序之间如何转变仍然知之不多，其主要原因在于没有筛选到性状稳定并且单一的叶序突变体。本研究前期通过体细胞突变技术获得大岩桐叶序突变体tricussate whorled phyllotaxis（twp）。该突变体性状单一，由对生叶序突变为轮生叶序；遗传分析显示为隐性单基因突变。本研究拟通过抑制消减杂交技术构建大岩桐野生型与突变体差异表达cDNA文库，经反向Northern杂交检测阳性克隆并测序；BLAST比对寻找差异基因序列，再结合RACE技术获得差异基因全长。在此基础上，通过时空表达模式、RNAi、过表达及功能互补分析差异基因在叶序调控中的功能。本研究的实施将对叶序调控分子机制的阐明奠定良好的基础。

植物叶序的形成可以追溯到叶原基在茎顶端分生组织（SAM）中的形成与排列方式，该过程受到以PIN1（pin formed1）与生长素正反馈调节为核心方式的调控。此外，细胞分裂素水平也参与了叶序的形成与调控。由于在SAM形成和功能维持中的作用，以及与生长素、细胞分裂素等激素积累密切的相关性，KNOTTED1-like homeobox （KNOXI）基因被推测在叶序调控中扮演重要作用。本研究利用同源克隆结合RACE方法从大岩桐获得了SsPIN1基因cDNA序列全长1770 bp。该基因编码365个氨基酸，SsPIN1蛋白含有2个pfam03547跨膜功能域、9个跨膜结构，且序列两端高度保守，属于膜运输蛋白家族中植物生长素运输载体家族。时空表达模式分析显示，SsPIN1基因在除根尖和块根外的所有组织中广泛表达，其中在腋芽、叶柄、茎等表达量最高。外源激素处理显示，茎尖和茎中的SsPIN1基因表达水平积极响应于外源生长素，尤其是外源NAA处理。菌落PCR及测序验证显示，SsPIN1基因亚细胞定位及过表达载体构建成功。进一步利用RT-PCR对大岩桐SsPIN2基因进行克隆获得898 bp的cDNA序列。经Blast比对、邻接法构建进化树发现该基因与黄瓜CsPIN2、豌豆PsPIN2基因等亲缘关系较近。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析显示该基因在不同组织中广泛表达，其中在茎尖、根、茎和花萼的表达量较高，在叶和花瓣中的表达量较低。采用同源克隆获得大岩桐SsKN1 基因451bp的cDNA序列，经 BLAST 比对、进化树分析发现大岩桐SsKN1基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近，其次为拟南芥STM基因；利用半定量 RT-PCR研究SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况显示，SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等四种组织中表达，在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高，叶中的表达量次之，根和花萼的表达量较低。在碎米荠中过表达PttKN1基因导致子叶数目及形态的明显改变，以及真叶、种子排列方式的改变。上述结果表明KNOXI基因在植物叶序的形成及维持中扮演重要作用，这一过程可能通过调控生长素及细胞分裂素平衡实现。这对叶序调控分子机制的阐明奠定了良好的基础。