小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因A309V点突变的功能解析

Abamectin is one of the most effectively and widely used insecticide for diamondback moth (Plutella xylostella) management. However, the sustainable control efficacy of abamectin has been threatened due to strong potential of resistance evolution in this pest.The diamondback moth has evolved high levels of resistance to abamectin in some locations of China. It is therefore essential to investigate the molecular mechanisms of abamectin resistance to facilitate implementing effective resistance monitoring and management strategies in diamondback moth. In this study, we will make use of an isogenic abamectin-resistant strain (Roth-Abm) to investigate molecular mechanisms of abamectin resistance. Our previous work showed that the A309V point mutation in the glutamate-gated chloride channel (PxGluCl)is genetically linked with abamectin resistance in the Roth-Abm strain. To characterize the effect of the mutation on biophysical properties of PxGluCl channel, the wild-type and mutant alleles of PxGluCl will be expressed in Xenopus oocytes, and electrophysiological and radioligand binding studies will be carried out. Our work is expected to demonstrate that PxGluCl is the major target-site of abamectin, and provide functional evidence that the A309V mutation is responsible for high levels of resistance to abamectin in the Roth-Abm strain of P. xylostella.

阿维菌素的大面积推广应用曾使难以治理的小菜蛾得到有效控制，然而小菜蛾对阿维菌素选择压力的适应性进化使该杀虫剂的可持续防控效能面临重大挑战，我国部分地区小菜蛾田间种群已对阿维菌素产生高水平抗性。明确小菜蛾对阿维菌素产生高水平抗性的分子机制，是开展小菜蛾抗性监测与治理的重要基础性工作。本项目以对阿维菌素极高抗的小菜蛾近等基因系为材料，以发现的与抗性连锁的小菜蛾谷氨酸氯离子通道（PxGluCl）基因A309V点突变为切入点，将目的基因导入爪蟾卵母细胞进行功能表达，并进行神经电生理和配基结合分析，以明确PxGluCl基因A309V点突变对阿维菌素结合能力及神经敏感性的影响，从而从功能上明确PxGluCl是阿维菌素的作用靶点以及PxGluCl基因A309V突变致使小菜蛾对阿维菌素产生高水平抗性的分子机理。

阿维菌素是用于小菜蛾化学防治的主要杀虫剂，对蔬菜害虫的抗性治理发挥着重要作用。近几年，不合理用药导致的小菜蛾阿维菌素高水平抗性已多有报道，但其抗性产生的分子机理尚不清楚。本项目构建了小菜蛾阿维菌素抗性近等基因系（Roth-Abm），通过敏感性回复实验和小菜蛾谷氨酸门控氯离子通道基因（PxGluCl）A309V突变频率检测，估算出PxGluCl基因A309V突变对抗性的贡献度约10倍；通过同源建模和自动配体对接分析，发现在开启状态、关闭状态和一个独特的脂质调控态的通道中，引入突变的侧链与周围氨基酸残基没有出现明显的空间冲突，认为该突变可能是通过氨基酸突变后导致的构象变化影响了其与阿维菌素的结合效能；为进一步明确PxGluCl基因A309V突变的功能特性，项目组将野生型和突变型的该基因cRNA注射到爪蟾卵母细胞进行外源表达。利用全细胞电压钳记录系统检测到PxGluCl基因A309V突变使通道对谷氨酸的敏感性没有明显变化，但阿维菌素的EC50值由0.16 μM（野生型）上升至0.78 μM（突变型），即PxGluCl基因A309V突变导致在受体水平对阿维菌素可产生中等程度但显著水平的（5倍，p = 0.0284）敏感性降低。综上，本项目从功能上证实了PxGluCl基因A309V突变可导致阿维菌素抗性，为阿维菌素作用于小菜蛾GluCl受体提供了直接证据，为其他物种阿维菌素的靶标抗性机理研究提供了重要借鉴。