玉米中编码一个具有C2结构域的蛋白的基因Zmcnp1功能研究

Maize is the most important crop, and which its growth, development, especially stage of the flowering is vulnerable to the impact of the drought. To explore and validate drought stress responsive gene has important significance for molecular breeding. The applicant's previous work had researched on maize expression profiles under the condition of drought stress and rewatering. a high expression gene (432 bp) has been cloned under the condition of drought stress and rewatering, we named Zmcnp1. The bioinformatic analysis showed that the gene encodes a protein containing C2 domain, while a variety of functions encoding protein containing C2 domain has been confirmed in plant. Recent research indicates that the genes are helpful for alleviating drought stress and salt stress. However, the functional study of gene encoding protein containing C2 domain has not been reported in maize. This study will use the bioinformatics, GUS expression, overexpression, RNAi, transgenic, qRT-PCR, fusion expression, subcellular localization, drought / salt tolerance experiments, to analysis characteristics of tissue expression and induced expression for the Zmcnp1 gene, the function of ZmCNP1 protein in maize, characteristics of calcium / phospholipid binding, transport, clarify the function of this gene under condition of drought / salt stress, and genes for improved crop drought, salt stress will ben discovered as an candidate gene.

玉米是最重要的作物，在其生长、发育，尤其花期极易遭受干旱的影响，因此发掘和验证旱胁迫响应的基因对分子育种具有重要的意义。申请人以所在课题组前期对玉米旱胁迫和复水条件下的表达谱的研究为基础，克隆到一个在旱胁迫和复水条件下表达量都很高的基因，长度为432 bp，我们将其暂命名为Zmcnp1。经分析该基因编码一个含有C2结构域的蛋白，而在植物中编码含有C2结构域的蛋白的基因具有多种功能。近来的研究指出该类基因有利于植物的抗旱和抗盐，但在玉米中尚未见编码含有C2结构域的蛋白的基因功能研究。本研究将用生物信息学、GUS表达、过表达、RNAi、转基因、荧光定量PCR、融合表达、亚细胞定位、耐旱、耐盐性实验等，对Zmcnp1基因的组织、诱导表达特性、在玉米中的功能以及蛋白ZmCNP1与钙离子/磷脂结合、转运特性进行研究，阐明该基因在旱、盐胁迫下的功能，期望获得可以用于改良作物旱、盐胁迫的候选基因。

玉米是最重要的作物，在其生长、发育，尤其花期极易遭受干旱的影响，因此发掘和验证旱胁迫响应的基因对分子育种具有重要的意义。申请人以所在课题组前期对玉米旱胁迫和复水条件先下的表达谱的研究为基础，克隆到一个在旱胁迫和复水条件下表达量都很高的基因，长度432 bp，我们将其暂命名为Zmcnp1。基因编码一个143 aa的N端含C2结构域的蛋白。Zmcnp1蛋白无信号肽，为胞内蛋白且主要分布于细胞质中。Zmcnp1一共存在7个假定磷酸化位点，且近N端的前5个均位于C2结构域内部，第一个假定的磷酸化位点为第12位的丝氨酸位点。对Zmcnp1基因编码区上游（ATG上游）1620 bp序列进行启动子预测分析，发现Zmcnp1基因核心启动子区在608-893 bp区域内，存在着TATA-box、CAAT-box和TA-rich region等启动子基本元件。将该段启动子与GUS报告基因相连，证实改启动子具有启动下游基因表达的活性；在该启动子区还发现了30种与逆境响应（如光、旱和病害等）相关的顺式作用元件，推测Zmcnp1基因可能参与植物逆境防御的调控。与PEG模拟的干旱诱导表达模式一样，在玉米自交系Z58、C7-2和B73品系中Zmcnp1基因在土壤缺水干旱环境下表达上调。通过Ca2+/ 磷脂结合实验，说明只有在Ca2+存在的情况下， Zmcnp1蛋白才能与磷脂的结合，指出Zmcnp1蛋白是一种依赖Ca2+的磷脂结合蛋白。将Zmcnp1基因导入拟南芥中进行异源表达，结果表明过表达株在100 mM D-Mannitol处理下根长较长，侧根较多，生长较对照较好；在50 mM NaCl的处理下过表达植株也有相似的表型，但存活率差异不显著；在AlCl3和CuSO4处理下，过表达植株的根长和侧根的长度与对照相比差异显著，这说明了Zmcnp1基因具有抵抗旱、盐和重金属的抵抗能力。进一步将Zmcnp1基因导入玉米中进行过表达，获得过表达Zmcnp1转基因玉米，通过荧光定量检测发现Zmcnp1基因在转基因玉米中的表达量比非转基因的表达量高，说明Zmcnp1基因确实在转基因玉米中过表达了。因此，Zmcnp1基因，在一定程度上能够提高植株的耐旱、耐盐和耐重金属能力，可以作为改良作物的旱、盐及重金属胁迫的候选基因。