电离辐射损伤修复中小肠干细胞自主性调控以及和Niche细胞对话研究

The crosstalk between intestinal stem cells (ISCs) and niche cells regulate several critical signal pathways activated in stem cells including Wnt and Notch, dominating the proliferation and differentiation status of intestinal stem cells . However, it remains obscure how these critical pathways are regulated in the tissue damage response and regeneration because of the challenge from isolating and enriching survival ISCs in damaged tissue. We have established a serial of methods for relatively enriching Lgr5+ ISCs and other niche cells from intestinal tissue during damage response and early tissue regeneration. So we will analyze the gene expression level of secretory factors derived from stem cells and Niche cells by using RNAseq. In addition, we will focus on the automatic regulation of ISC and interrogate the role of secertory factors derived from ISC on ISC proliferation, differentiation and regeneration in the 3D organoid culture system by manipulating their expression. In summary, we expect to get the primary cross talk pattern between ISC and Niche cells during irradiation damage and repair and also understand the mechanism of ISC automatic regulation under physiological and stress conditions.

小肠干细胞通过和Niche细胞"对话"精细调控Wnt 和 Notch等关键信号通路来维持其增殖分化平衡，但这些信号通路在辐射后干细胞再生、重建中的调控机制还远未阐明。通过前期探索，我们建立了高通量细胞流式分选方法，可以分离、富集正常和辐射后不同时期的小肠上皮干细胞和相关Niche细胞，将通过转录组测序等技术明确干细胞和Niche细胞来源调控因子在辐射前后的动态表达。另外，以往研究大多关注Niche细胞来源调控信号，忽略了干细胞自主性分泌的调控因子，因此我们将在干细胞和Niche细胞对话网络中侧重分析后者的角色和作用，并将在体外培养的肠类器官中通过干预相关信号通路来分析其对干细胞分化以及辐射后损伤修复的影响。本课题预期将首次明确小肠干细胞和多种Niche细胞在辐射损伤修复中的"对话"模式，并明确干细胞自主性分泌的调控因子在生理和病理条件下对干细胞调控的相关分子机制。

小肠干细胞正常情况下自身的增殖和分化以及辐射损伤后的再生等都受到Niche信号的精确调控，并且肠干细胞也会做出应答来调控Niche细胞。目前，肠干细胞和Niche细胞在辐射损伤修复过程中的对话机制还远不清楚。本研究通过对分选的辐射前后的肠干细胞/前体细胞、隠窝细胞、绒毛分化细胞和肠间质成分进行一系列转录组分析，初步明确了辐射损伤相关的基因表达模式，通过分析分泌蛋白和相关受体的表达，初步明确了ISC细胞和Niche细胞的对话的候选关键网络节点。同时，我们确认了肠隠窝干细胞G2/M期的形态，提示细胞周期的调控可能参与了ISC和Niche细胞的对话调控。明确了干细胞本身来源的Sfrp5，Igfbp4这两种Wnt inhibitor在隠窝细胞中的表达模式，构建了相关的基因修饰动物，初步明确了这两种蛋白对正常干细胞增殖分化稳态和再生修复的影响。为了更准确的评估类器官的增殖和再生，我们建立了新的成像和数据分析方法，有效避免了3D培养体系和细胞死亡带来的干扰，并确定了相关的内参照标准，为以类器官为基础的放射防护药物筛选提供了目前最客观的自动化体系。根据转录组相关数据，我们选取了辐射后间质细胞高表达的IL-22 作为研究靶点，在类器官水平初步明确其在某些剂量条件下可以起到辐射防护作用，正在进一步探讨其在体应用的可能性和相关的机制。转录组数据还提示Lgr5干细胞本身高表达FGFR2 和FGFR3，因此我们还利用肠上皮条件性敲除小鼠初步探讨了FGFR通路对干细胞增殖分化和再生的影响。总之，本项目不仅为肠干细胞和Niche细胞辐射损伤修复中的对话研究提供了基本数据，明确了干细胞本身来源一些重要信号的作用，锚定了一些Niche来源信号的靶点，为下一步更深入的机制和转化研究奠定了重要基础。