肝X受体调控胰岛β细胞SKP2信号通路的分子机制

胰岛β细胞总量和功能的稳态平衡是通过细胞增殖、新生、凋亡等过程来实现的，以适应机体代谢变化的需要，其数量减少是糖尿病发病的核心环节。我们实验室在近期研究中发现，核受体肝X受体（LXR）能够下调S期激酶相关蛋白2（SKP2）的水平，从而减少细胞周期依赖激酶抑制剂（p27Kip1）的泛素化降解，最终导致β细胞周期停滞，出现增殖障碍。本研究将在此基础上进一步明确胰岛β细胞中LXR异常激活下调SKP2水平的分子机制。我们在前期工作中已经证明LXR的异常激活能够下调SKP2基因的转录活性，但这种调控并非直接的调控作用，而是通过其他因子来实现的。本课题以小鼠离体胰岛和胰岛β细胞系作为研究对象，通过基因芯片等方法筛选介导该调控作用的相关因子，并验证其对胰岛β细胞增殖的作用。本项目有助于深入阐明胰岛β细胞总量和功能稳态调节的分子生物学机制，为明确糖尿病的发病机理和促进胰岛细胞再生治疗提供新思路和新靶点。

本研究采用荧光素酶报告基因活性检测（luciferase assay）、蛋白免疫印迹（Western-blot）、实时定量PCR、基因芯片等多种实验方法，初步揭示了胰岛β细胞中肝X受体（liver X receptor，LXR）对Skp2基因的调控机制。首次阐明：（1）肝X受体对Skp2基因的调控序列主要是在Skp2基因转录起始位点上游-289~-38nt的区域。为了明确LXRs异常激活抑制Skp2启动子活性的区域，我们构建了一系列含Skp2启动子截短的荧光素酶报告质粒。通过比较其中包含的不同截短长度Skp2启动子活性的高低，发现，在转染了PGL-289质粒后，Skp2启动子区活性仍然受到LXRs的抑制，而转染了PGL-38质粒后，该抑制作用消失，Skp2启动子区活性不再受到LXRs的影响。因此，我们确定LXRs异常激活后抑制Skp2转录的调控区域是在Skp2转录起始点上游-289~-38nt的位置。（2）LXRs的异常激活通过抑制PIK3CA与PIK3CD基因的表达而阻断了PI3K/Akt信号通路，从而降低了E2F1的水平，导致Skp2基因的表达下调。通过基因芯片我们检测了LXRs异常激活后胰岛β细胞内众多基因mRNA水平的变化，发现编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylino-sitol 3-kinases，PI3Ks）p110催化亚单位的PIK3CA和PIK3CD基因及其下游E2F1基因的表达均发生了显著降低，而Western-blot和实时定量PCR实验也验证了这一结果。据此我们得到结论：LXRs的异常激活通过抑制PIK3CA和PIK3CD基因的表达而阻断PI3K/Akt信号通路，进而通过降低E2F1的水平来下调Skp2的表达。总结为：LXR异常激活→PIK3CA和PIK3CD基因表达下降→PI3K的p110亚基（催化亚单位）减少→PI3K/Akt信号通路障碍，Akt的磷酸化被抑制→E2F1基因表达下调→Skp2基因表达下降。在本课题中，我们基本阐明了胰岛β细胞中肝X 受体调控Skp2的分子机制，为糖尿病的防治和促进胰岛细胞再生治疗提供了新的靶点。