基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的研制及其在蛋白质复合物解析中的应用

With the application of CXMS analysis still limited by the low abundance of cross-linked peptides, the high complexity of MS spectra and the quadratic expansion of the computational search space, our project aims to develop a novel enrichable and MS/MS-cleavable cross-linker. By using disaccharide as the body of the cross-linker, given the significant difference between the fragmentation energy for glycosidic bond and peptide bond, the cross-linker and cross-linked peptides could be controllably fragmented with high selectivity. With the spectra for cross-linked peptides transformed into that for common peptides modified with the residue of cross-linker, the complexity of MS spectra could be significantly reduced, helping to tackle the problem of quadratic expansion of the computational search space. In addition, by introducing alkynyl groups into the cross-linker, the cross-linked peptides could be enriched efficiently via click-chemistry reaction, improving the abundance of cross-linked peptides. Furthermore, the fragmentation rules of the obtained cross-linked peptides should be systematically studied to build the ion index relationship between the cross-linked peptides and common peptides modified with the residue of cross-linker, based on which an algorithm used for cross-linked peptides qualitative and MS1-based label-free quantification analysis with universality and high accuracy is under exploitation. Based on above mentioned, a large-scale CXMS-based protein complexes analysis could be achieved, offering important technological support for studying the spatial structure of protein and protein-protein interaction network.

针对现有基于化学交联-质谱技术的蛋白质复合物分析中存在的交联肽段丰度低、谱图复杂识别度低和数据检索规模大的问题，本项目侧重研制带有富集标签的质谱可碎裂化学交联剂。以二糖单元作为交联剂的骨架，利用糖苷键和肽键碎裂能量的显著性差异，实现交联试剂和交联肽段肽键的高选择性可控碎裂。通过将交联肽段的谱图解析转化为带有交联剂残基修饰的普通肽段的数据解析，显著降低交联肽段的谱图复杂程度，进而缩减其数据检索的规模。此外，在交联试剂中引入炔基作为富集基团，通过点击化学反应，实现交联肽段的高效富集，避免非交联肽段的干扰。在上述基础上，系统研究交联肽段的碎裂规律，确立交联肽段和带有交联剂残基修饰的普通单肽的离子索引关系，开发交联肽段定性与定量解析的算法，提高其解析的普适性和精准度，从而实现基于化学交联-质谱解析新方法的蛋白质复合体规模化分析，为研究蛋白质的空间结构及蛋白质-蛋白质相互作用网络提供重要的技术支撑。

针对目前基于化学交联-质谱技术的蛋白质复合物分析中存在的交联肽段丰度低、谱图复杂识别度低和数据检索规模大的问题，本项目通过合成了以海藻糖二糖为骨架的高生物兼容性质谱可碎裂型交联剂TDS，利用糖苷键和肽键碎裂能量的选择性差异，实现交联试剂的糖苷键和交联肽段的肽键之间高选择的可控碎裂，提高交联肽段的谱图识别度；系统研究交联肽段的碎裂规律，将交联肽段的谱图解析转化为带有交联剂残基修饰的普通肽段的数据解析，最终建立了基于TDS质谱可碎裂交联剂蛋白质复合物构象和相互作用位点的高通量精准解析方法。该方法不仅将交联肽段的候选数据库规模缩减为与普通肽段同等规模，显著降低交联肽段的数据检索规模，并且将交联肽段谱图鉴定的b/y离子匹配数目提高了2倍，显著地提高了蛋白质复合物的鉴定准确度，实现了不同理化性质的纯化蛋白质、26S蛋白酶体复合物以及人源BEL7402肝癌细胞系中蛋白质复合物的精准解析；通过发展了一种滤膜辅助的基于多酶酶切策略的化学交联蛋白质复合物结构位点信息鉴定方法，解决了交联蛋白质酶切过程中因trypsin不能对发生交联的赖氨酸进行酶切，使得交联肽段比普通肽段更长及存在多级交联，不利于质谱鉴定和交联数据搜索而造成的交联位点鉴定覆盖度低的问题，将E.coli全裂解液交联蛋白的位点鉴定数目增加了1.3倍，显著地提高了交联位点的鉴定覆盖度；通过在交联剂中引入炔基等可富集基团，建立了基于点击化学的交联肽段高选择性富集方法，富集效率高达99.1%，交联肽段的鉴定数目提高了60倍。应用于人源样品的蛋白质复合物解析，相较于文献中报道的DSSO交联方法（Nature Methods, 2015, 12, 117），蛋白质相互作用位点的鉴定数目增加了78%，显著地提高了蛋白质交联信息的鉴定覆盖度。同时，较富集前的交联肽段，富集后的交联肽段的二级谱图中碎片离子匹配质量以及对应谱图匹配数明显提高，从而显著地提升了交联肽段的鉴定准确度；将上述方法相结合，为推动蛋白质结构解析和蛋白质-蛋白质相互作用的研究，以及其功能分子机制的揭示和调控提供了关键的技术支撑。发表论文9篇，其中SCI论文7篇，会议论文6篇，申请发明专利10件，培养研究生3名。