脑CYP2D原位代谢行为及脑区依赖性调控作用研究

本研究拟以外源物尼古丁和内源物孕酮为代表，系统阐明脑CYP2D原位代谢功能及脑区依赖性调控行为特征，以深入认识脑CYP2D作为中枢活性物质原位代谢途径的理论价值及在药理毒理学方面的意义。项目将利用整体柱固相微萃取技术结合液相串联质谱（LC-MS/MS）分析技术，进行不同脑区的定位研究，分析尼古丁和孕酮对脑CYP2D催化功能、代谢行为的影响以及脑区调控差异；通过微透析技术，进行药动学与药效学结合模型（PK/PD modeling）研究，阐明调控脑CYP2D对中枢活性物质生物相浓度及药效学的影响；从不同调控水平，探讨脑CYP2DmRNA、蛋白表达和催化功能之间的调控关系；阐明孕酮调控效应-浓度-时间之间的变化曲线。尼古丁为广泛滥用物质，孕酮为神经活性甾体，研究两者对脑CYP2D独立于肝脏的器官特异性调控特征，以深入揭示脑CYP2D生物学行为，将具有重要理论价值和潜在的临床实际意义。

脑是机体最为重要的器官，承担着调控体内内环境稳定以及对外环境作出反应的重要任务。由于血脑屏障的存在，脑组织与血液之间的物质交换种类、交换量和速度受到制约，从而形成了相对独立于外周组织的脑内环境。由于中枢活性物质的靶器官为脑组织，故脑内环境中底物浓度改变可能导致药效学行为变化。脑CYPs因具有脑区选择性和细胞选择性表达分布的特点，可能原位参与中枢活性物质代谢失活及活化。在CYP超家族中，CYP2D介导中枢活性物质代谢失活及活化的重要亚族。CYP2D参与临床上20~30%药物的代谢，其中1/3以上药物属于中枢神经系统药物，包括镇痛药物,多数抗抑郁药物, 以及抗精神病药物。. 课题采用实时定量RT-PCR，Western blotting，免疫组织化学、液相与三重四极杆串联质谱(LC-MS/MS)等技术，分析了CYP2D在不同脑区的表达和调控特征。脑CYP2D在脑中表达含量高，分布广，在大脑皮层、丘脑、海马、黑质纹状体、小脑均有表达，且具有功能活性。大鼠CYP2D具有CYP2D1，2，3，4，5和18不同亚型，不同亚型分布在不同脑区，其中以CYP2D2和CYP2D4呈现高表达。同时，对比其他脑CYPs（如CYP2E1）的表达调控特征，分析了内源性物质（睾酮）和外源性物质（尼古丁）对脑CYP2D不同脑区的影响，以及不影响肝脏CYP2D表达水平的调控特点。雄性大鼠去势后，小脑、脑干和额叶皮层的CYP2D水平明显升高，丘脑和海马CYP2D水平的略有上升，但肝脏CYP2D水平无改变；给予生理剂量的睾酮可在转录水平消除去势所引发的脑CYP2D改变。结果提示，睾酮是影响雄性大鼠脑CYP2D水平的重要内源性物质。雌性大鼠怀孕后，脑和肝脏CYP2D水平均可出现改变。尼古丁可在转录后水平诱导选择性诱导雄性大鼠小脑、海马及纹状体CYP2D水平。尼古丁对人神经细胞所表达的CYP2D6亦具有转录后水平的调控作用。我们选择镇痛药物曲马多，通过PK/PD 模型研究发现，尼古丁可通过选择性诱导脑CYP2D水平导致其底物药物曲马多的量效曲线左移和上移。此项研究结果表明，脑CYP2D具有代谢中枢活性物质的功能，且其表达水平可明显影响中枢活性物质在靶器官的效应。研究为深入揭示脑CYP2D生物学行为奠定了基础，以及对于分析内、外源物对脑中的活性物质的原位代谢的影响有重要意义。