华南地区野生大豆耐酸铝相关基因挖掘及分子机制的研究

The most of soil in South China is typical acid soils where wild soybean is widely distributed and undergoes long-term natural selection. Al toxicity is a major limitation to crop production on acid soils in South China. In this study, we analyzed gene expression of wild genotype (BW69) to Al stress by Agilent Soybean Gene Expression Arrays (4x44K Whole Soybean Genome 60‐mer oligonucleotide microarrays). The spectrum showed that 1268 and 3679 genes of differentially expressed more than 2 times were found from root and shoot of BW69, respectively, accounting for 0.35% and 1.03% of chip probe.We identified 32 novel miRNAs by high-throughput sequencing，and found that the　 expression of 34 conserved, less conserved or novel miRNAs was responsive to Al stress. And then plasmids of over expression and RNAi were constructed, candidate genes were cloned and transferred into the soybean genome using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, homozygous T2 transgenic plants were obtained. The transgenic lines were analyzed by genomic DNA hybridization and quantities real-time PCR analysis. Therefore, wild soybean of tolerance gene is excavated for the south of soybean breeding and improvement of aluminum stress to provide the theory basis.

我国南方有大面积酸性土壤,铝毒是酸性土壤限制作物生长的主要因素,研究和选育耐酸铝品种有重要意义。本研究在野生大豆耐酸铝筛选和鉴定基础上，选择高耐野生大豆资源BW69，采用Agilent大豆表达谱芯片技术检测铝诱导下基因表达谱。从根系和地上部分分别找到了1268和3679个大于2倍差异表达的基因，占芯片探针数量的0.35%和1.03%。通过miRNA测序，找到了32个新miRNA和34个受铝诱导表达的miRNA。在此基础上筛选耐酸铝的功能基因克隆并构建超表达和RNAi载体。通过农杆菌介导法进行遗传转化,获得T2代转基因株系。利用RT-PCR、Real-timeRT-PCR、Southern杂交技术，进行转基因株系的分子鉴定。同时对转基因T2代株系进行耐酸铝特性鉴定。利用RT-PCR和芯片技术研究功能基因耐酸铝特性的分子机制。因此，挖掘耐酸铝基因，为南方大豆抗铝毒胁迫育种工作提供了理论依据。

我国南方有大面积酸性土壤,铝毒是酸性土壤限制作物生长的主要因素,研究和选育耐酸铝品种有重要意义。本研究在野生大豆耐酸铝筛选和鉴定基础上，选择高耐野生大豆资源BW69，采用Agilent 大豆表达谱芯片技术检测铝诱导下基因表达谱。从根系和地上部分分别找到了1268 和3679 个大于2 倍差异表达的基因，占芯片探针数量的0.35%和1.03%。通过miRNA 测序，找到了32 个新miRNA 和34 个受铝诱导表达的miRNA。通过芯片和高通量miRNA 及降解组测序技术，获得野生大豆耐酸铝基因柠檬酸转运子基因 Gs MATE(登录号 BM732932.1)。Gs MATE 全长 1955 bp，开放阅读框长1503 bp，编码 500 个氨基酸。除此之外，Gs MATE 位于第二条染色体上，包含 13 个外显子，12 个内含子。序列保守区域分析发现 Gs MATE 是 MATE 家族蛋白，含有 2 个 Ma TE DNA 结构域。进化树分析结果显示，Gs MATE 所有同源蛋白都与铝毒/铁转运相关。亚细胞定位结果表明该基因在细胞膜表达, 而且Gs MATE 主要在根部表达，在其他组织中表达量很低。在对照条件下，Gs MATE 在距根尖 0-2 cm 根段的表达量最高，在离根尖大于2 cm 的根段中，Gs MATE 表达受铝诱导后表达上调且达显著水平。通过农杆菌GV3101 介导遗传转化拟南芥获得转基因拟南芥，在拟南芥中过表达 Gs MATE。在铝处理下，转基因拟南芥相对于野生型拟南芥根相对伸长更明显，且在苏木精染色下，转基因拟南芥相对于野生型拟南芥根系染色更浅。综上所述，本项目明确了 Gs MATE 的功能，参与野生豆耐铝分子机制，这为培育和改良适应酸性土壤的大豆品种提供了理论基础。项目资助发表核心论2篇，待发表两篇。培养硕士生3名，其中1名已经取得硕士学位，2名在读。项目投入经费82万元，支出82万元，各项支出与预算相符。