机械通气所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白的筛选、鉴定及其信号转导通路研究

Ventilator-induced lung injury (VILI) is the common and serious complication of mechanical ventilation treatment. The nature of VILI is the expression and release of cytokines induced abnormal mechanical force, which causes or worsens lung injury. We and others recently identified that high mobility group box 1 protein (HMGB1) is an important late inflammatory mediator of VILI, which provide new target and "time window" for the treatment of VILI. However its gene transcription regulation mechanisms need to be clarified. Biotin-streptavidin system, with the μMACS magnetic beads separation technology, will be used to screen different expressed protein that combined with HMGB1 promoter in the nuclei of VILI rat lung tissue. The proteins will be identified by mass spectrometry. And gene transfection, reporter gene and RNA interference techniques will be used to study regulation function of the proteins. The aim of our project is to identify proteins that regulate HMGB1 transcription of VILI rat and its related signal transduction pathway from the viewpoint of "-omics" and living tissues, and to clarify the regulation mechanisms of HMGB1 transcription and expression, and to provide new drug target and treatment methods for VILI.

机械通气所致肺损伤(VILI)是机械通气治疗时常见而严重的并发症，其实质是异常的机械力诱导大量细胞因子的表达和释放，引起或加重肺损伤。我们及他人的最新研究均证实，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是介导VILI发生的重要"晚期"炎症介质，为临床治疗VILI提供了新的靶点和"时间窗"，但其基因转录表达调控机制尚未阐明。本研究使用生物素－链亲和素系统，利用磁珠分离μMACS技术筛选VILI大鼠肺组织细胞核中与HMGB1启动子结合的差异蛋白，并行质谱鉴定；进而通过基因转染、报告基因以及RNA干扰技术对差异蛋白的调控功能进行研究，以期从"组学"的角度和活体组织水平鉴定VILI时调控HMGB1转录表达的蛋白及其相关的信号转导通路，阐明VILI时HMGB1转录表达的调控机制，并为VILI提供新的药物靶位和治疗途径。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是介导VILI发生的重要"晚期"炎症介质，我们完成了对HMGB1启动子差异结合蛋白的筛选，通过质谱鉴定得到4个候选结合蛋白，并进一步用液相蛋白芯片系统检测启动子与融合蛋白结合的平均荧光强度，鉴定二者的相互作用位点。进一步研究证实应用EGFR拮抗剂可阻断配体依赖途径的EGFR激活，进而抑制HMGB1蛋白表达，表现出对肺损伤的保护作用，提示EGFR阻断剂应用于VILI的可能性，为VILI的防治提供新的思路。我们采用脂质体转染技术，将体外合成的靶向HMGB1的小干扰RNA（siRNA）导入肺泡巨噬细胞（AM），发现干扰HMGB1表达可有效抑制机械牵张诱导AM释放IL-1、IL-6、MIP-2等多种炎性因子，探讨了siRNA HMGB1治疗VILI的可行性。在筛选机械通气肺损伤时引起HMGB1表达增加的信号通路时，发现膜骨架连接蛋白—埃兹蛋白(Ezrin)这一关键信号分子，并在体外细胞牵张模型中证实ROCK激酶信号通路介导了机械牵张诱导的Ezrin蛋白磷酸化及HMGB1表达。在动物HS-R模型和体外细胞缺氧/复氧模型中，发现通过TIFA siRNA转染抑制TIFA表达可显著降低缺氧/复氧诱导的HMGB1表达和释放，并进一步证实缺氧/复氧以TLR4-MyD88依赖的方式诱导TIFA表达快速上调，进而引起NF-κB通路激活和HMGB1表达。我们与美国匹兹堡大学Billiar教授合作，首次应用TEG技术发现HS-R可诱导血小板功能减低，血小板TLR4介导了HS-R诱导的血小板功能障碍以及血小板在肝和肺的聚集，而基因敲除血小板TLR4可以阻断HS-R引起的循环IL-6增加以及肝和肺组织损伤，表明血小板TLR4是联系凝血和炎症的关键性分子，为血小板TLR4参与炎性信号通路开启了新的思路。