HIV-1蛋白酶抑制剂Ahmpatinin iBu的生物合成机制研究

AIDS is a significant public health event in the word. HIV-1 protease inhibitors play an important role in AIDS treatment. However, the clinic drugs have serious drug resistance, lower bioavailability and adverse effects. It is necessary to discover novel compounds with HIV-1 protease inhibitory activity. Ahmpatinin iBu is a novel oligopeptide compound discovered from Streptomyces sp. CPCC202950 in our previous studies. It has significant inhibitory activity against HIV-1 protease with IC50 at 1.79 nM, can be regarded as a lead compound. The biosynthesis mechanism of Ahmpatinin iBu is still unclear. On the basis of the genetic transformation system of Streptomyces sp. CPCC202950, this project is aimed to find the biosynthetic gene cluster and reveal the biosynthesis mechanism of it. Therefore, the biosynthetic gene cluster of Ahmpatinin iBu is deduced by combining the structural characteristics and bioinformatics analysis of the genome sequence of Streptomyces sp. CPCC202950. The complete compositions of the gene cluster are determined through molecular biology methods such as gene knockout, replenishment, overexpression and transcriptional level examination. The functions of the key enzymes are verified by structure identification of the intermediate. This project can not only enrich the biosynthetic gene clusters of oligopeptides, but also improve the assembly principle of the non-ribosomal peptide synthetase - polyketide synthase (NRPS-PKS) biosynthetic pathway. Finally, the study will provide a reference for discovering novel HIV-1 protease inhibitors by using synthetic biology techniques.

艾滋病是全世界重要的公共卫生问题，HIV-1蛋白酶抑制剂在其治疗中具有重要作用，但现有药物存在耐药性严重、生物利用度低和副作用大等不足，仍需寻找新型的蛋白酶抑制剂。Ahmpatinin iBu是本项目组从链霉菌CPCC202950中发现的结构新颖的拟寡肽类化合物，具有显著的HIV-1蛋白酶抑制活性，IC50为1.79 nM，有较好的应用前景，但其生物合成机制尚不清晰。因此，在建立产生菌遗传转化体系的基础上，本项目拟以Ahmpatinin iBu结构特征为线索，结合生物信息学分析，推测其可能的生物合成基因簇；通过基因敲除、回补、过表达和转录水平考察等分子生物学手段确证完整的基因簇组成；结合中间体结构对关键酶进行功能分析和验证，最终解析其生物合成机制。本项目的实施既可丰富拟寡肽类的生物合成基因簇，又可完善其合成组装原理，对利用合成生物学技术发现新型HIV-1蛋白酶抑制剂具有积极的指导意义。

艾滋病是全世界重要的公共卫生问题，HIV-1蛋白酶抑制剂在其治疗中具有重要作用，但现有药物存在耐药性严重、生物利用度低和副作用大等不足，仍需寻找新型的蛋白酶抑制剂。Ahmpatinin iBu是本项目组从Streptomyces sp. CPCC 202950中发现的Pepstatins (PEPs)类似物，具有显著的HIV-1蛋白酶抑制活性，有较好的应用前景。本项目在对Streptomyces sp. CPCC 202950全基因组测序的基础上，以PEPs的结构特征为线索，结合生物信息学分析，通过基因敲除、基因簇异源表达、13C同位素标记、代谢产物分离纯化、结构鉴定以及体外酶反应等方法确定了PEPs生物合成基因簇并阐明了其生物合成机制。PEPs由单模块与多模块迭代、非线性NRPS-PKS杂合基因簇合成。pepF编码MbtH蛋白，在PEPs的生物合成中十分重要。pepJ为关键正调控因子，过表达pepJ使pepstatins的产量提高约一倍。PepI为新型的酮基还原酶，负责催化statone的β-酮基还原形成非天然氨基酸statine。Ahmpatinin iBu为PEPs生产过程中氨基酸单元错配的产物。通过发酵优化，从野生型A3培养基中分离得到新化合物pepstatin Ti（6），此外还从敲除pepI的突变株分离鉴定到3个新化合物pepstanone Ac（14）、pepstanone Pr（15）、pepstanone iBu（16）。体外抗HIV-1蛋白酶活性筛选结果显示，化合物6对HIV-1蛋白酶抑制活性良好，但14-16无明显抑制活性，表明statine单元对HIV-1蛋白酶抑制活性至关重要，起始的N-酰基单元对其活性影响较小。综上所述，本项目的实施为进一步利用合成生物学开发结构新颖、高效的HIV-1蛋白酶抑制剂提供了研究基础，对全面研究酸性蛋白酶抑制剂的生物合成具有一定的借鉴意义。