ATGL的定位和活性调控机制及对心功能的影响

Myocardial metabolic remodeling plays a pivotal role in the pathogenesis of heart failure. The aberrant metabolism in triglyceride (TAG) hydrolyzation and fatty acid β-oxidation are the key reasons due to the cardiomyocyte metabolic disorder. Lipid droplets (LDs), the intracellular fat storage organelles, play crucial role in maintain celluar energy metabolic homeostasis. Our preliminary data show that the intracellular distribution of ATGL is dramatically changed in the failing heart with the translocation of a mount of ATGL from the lipid droplet to the cytosol, indicating the location of ATGL is related with metabolic remodeling in the failing heart. This project will explore the regulation of the activity and location of ATGL in cardiomyocytes and investigate the relationship of the activity and location of ATGL with the lipid metabolism as well as with the cardiac function. Through bioinformatics predictions and proteomics analysis, we have determined two phosphorylated sites in ATGL. We will first explore the variation of phosphorylation level of these two sites in the normal and failing heart. Through the mutation of these two sites, we will further investigate the effect of phosphorylation on the location and activity of ATGL. Furthermore, by modifying the gene, we will add a lipid droplet specific binding sequence to ATGL to promote its lipid droplet targeting, thus we can explore the influence of the LD-binding ATGL on TAG metabolism in cardiomyocytes. Based on the above experiments, we will combined all the obtained information to investigate that if we increase the LD localization and phosphorylation status of ATGL, it will promote the cardiac function in cardiomyocyte-specific ATGL transgenic mice. This research will provide the theoretical basis for the imbalanced lipid metabolism of cardiomyocytes, and may introduce new directions for the future research on the etiology and treatment of heart failure.

心脏能量代谢紊乱与心功能下降密切相关，其中甘油三酯水解及脂肪酸氧化磷酸化障碍是主要环节。甘油三酯脂肪酶(ATGL)是甘油三酯水解的关键酶，本项目将探索ATGL的定位与活性的调节及其对心功能的影响。预实验结果表明心衰模型鼠心肌ATGL的脂滴定位显著减少，而胞浆定位增加，提示ATGL脂滴定位的减少可能导致心脏能量代谢紊乱并引起心功能的下降。通过生物信息学预测、蛋白质谱分析及蛋白过表达研究确定了影响ATGL活性的两个磷酸化位点，之后我们将考查这两个位点在心衰时的磷酸化变化及调节；通过定点突变考查磷酸化对ATGL脂滴定位和活性的影响；通过增加脂滴定位序列,考查ATGL的脂滴定位对甘油三酯代谢的影响；构建心肌特异性高活性ATGL转基因鼠研究ATGL磷酸化及定位对心功能的影响。本研究将为心脏能量代谢紊乱提供新机制，并为心衰的防治提供新思路。

心脏是一个高耗能器官。成年人心脏主要能量来源是脂肪酸，心肌细胞脂代谢紊乱是导致心功能不全的关键因素。而脂肪甘油三酯水解酶（Adipose Triglyceride Lipase，ATGL）是这一过程的关键限速酶。目前已证明ATGL与心功能以及心衰的发生发展有很大关系。我们的假说认为ATGL的激活与其发生磷酸化修饰有关。本项目的研究内容就是探索心衰过程中ATGL磷酸化位点的变化及相应的功能。. 到目前为止，已通过质谱技术鉴定了ATGL的10个磷酸氨基酸位点。我们建立了ATGL的单位点磷酸化检测系统：即在ATGL十个位点负显性突变质粒的基础上，构建目标位点为正常没有突变的质粒，转染细胞以后通过免疫沉淀实验纯化带有FLAG标签的ATGL蛋白，然后通过Western Blot 实验用通用磷酸化抗体检测ATGL是否发生磷酸化，由于ATGL可磷酸化修饰的位点除了目标位点以外都做了永久去磷酸化突变，因此检测到的磷酸化变化就是目标位点的磷酸化变化。利用ATGL的单位点磷酸化检测系统我们研究了心衰相关的ATGL磷酸化修饰。血管紧张素2（angiotensin II ）处理小鼠心肌细胞HL-1构建心衰的细胞模型，在此基础上检测了angiotensin II对ATGL磷酸化位点的影响。构建高活性ATGL的腺相关病毒，感染心衰小鼠，证明高活性ATGL对心衰有缓解作用。我们发现吗啡急性处理可以通过抑制ATGL Ser406的磷酸化引起心肌细胞中的甘油三酯积累。ATGL S47的磷酸化可以促进ATGL与脂滴的结合。. 我们的实验结果提示ATGL的不同磷酸化位点分工不同，且相对应不同的刺激。说明ATGL磷酸化修饰对其功能的影响具有复杂性。我们建立的蛋白质单位点磷酸化检测系统以已经进入到专利实审阶段，作为一种研究工具，具有转化意义。