αA晶体蛋白在视网膜新生血管形成中的作用及机制研究

Anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapy can block the growth of neovascularization , but there is resistance in the anti -VEGF treatment and anti-tumor therapy .There is evidence that anti- VEGF resistance is induced by intracellular self-regulation of the intracellular signal transduction pathway . α A -crystallin(CRYAA) is an important molecular chaperone protein .It plays an important role in cell protecting by activating intracellular signal transduction pathways . Our last country natural subjects showed the important cytoprotective role of CRYAA. Based on this, we take in sight the role of CRYAA in retinal neovascularization .Our previous research found out that CRYAA can have pro- angiogenic effect . How dose CRYAA function ,whether independent or on VEGF signal pathway ? What is the exact mechanism like ? This project intends to further explore the functional mechanism of CRYAA in retinal neovascularization.We research on hypoxia cultured vascular endothelial cells and oxygen induced retinal neovascularization model of CRYAA-knockout mice. Cell culture , RT -PCR, Western-blot, ELISA , and gene transfaction techniques are used both in animal and cellular level for the research of CRYAA function on retinal neovascularization . Looking forward to new therapy for anti-VEGF in clinical treatment.

抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）疗法可阻断新生血管生长，但在治疗眼底新生血管性病变及抗肿瘤的过程中发生了抗血管生成治疗抵抗的现象，已有证据表明抗VEGF抵抗通过胞内信号通路的自我调节完成。α晶体蛋白（CRYAA）分子是重要的分子伴侣蛋白，主要通过激活细胞内自我保护信号转导通路而发挥作用。前一个国自然课题结果显示CRYAA具有重要细胞保护作用，在此基础上研究发现CRYAA具有促视网膜血管增生作用，那么CRYAA调控血管新生形成的机制如何呢？项目拟在前期工作基础上进一步探讨CRYAA在眼内新生血管中的作用机制，以缺氧条件下培养的血管内皮细胞及缺氧诱导基因敲除小鼠视网膜新生血管形成、激光诱导脉络膜新生血管为模型，运用细胞培养、RT-PCR、Western-blot、ELISA及基因转导等技术，在细胞水平与动物水平研究CRYAA对新生血管的影响与分子机制，为临床抗VEGF治疗提供新方法或辅助手段。

抗血管内皮细胞生长因子（VEGF）疗法可阻断新生血管生长，但在治疗眼底新生血管性病变及抗肿瘤的过程中发生了抗血管生成治疗抵抗的现象,α晶体蛋白（CRYAA）分子是重要的分子伴侣蛋白，具有细胞保护，促视网膜血管增生作用。本课题组围绕CRYAA在视网膜新生血管中的作用开展了三部分研究。第一部分探讨CRYAA在视网膜新生血管中的作用机制，通过基因敲减的血管内皮细胞及缺氧诱导CRYAA基因敲除小鼠视网膜新生血管形模型、激光诱导脉络膜新生血管(CNV)模型，运用细胞培养、 RT-PCR、 Western-blot、 ELISA 及基因转导等技术，在细胞水平与动物水平研究 CRYAA 对视网膜新生血管的影响与分子机制，研究结果证实使用siRNA将CRYAA基因敲减不仅可以促进HUVEC细胞凋亡，还会显著降低细胞的增殖、迁移、成管等细胞行为学改变。CRYAA(-/-)小鼠的OIR、CNV模型新生血管明显下降。CRYAA基因敲减的HUVEC及CRYAA(-/-)小鼠网膜中的VEGF分泌量均减少，VEGFR2分子信号通路被抑制，同时VEGFR2，AKT，PLCγ1，FAK，Src,p42/p44MAPK及p38MAPK的磷酸表达明显减低。此外，基因敲除显著促进了caspase-3以及caspase-9活性片段的表达。CRYAA基因敲除通过抑制VEGF及VEGFR2信号通路减少病理性新生血管形成。第二部分研究纳入nAMD及PCV患者，提取受试者静脉血白细胞基因组DNA，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测基因多态性，采用Fisher 确切概率检验结果提示αA 晶状体蛋白基因中rs7278468 可增加中国北方人群患 nAMD 的风险，证明CRYAA不仅在功能学上与CNV相关，在遗传学上也与新生血管密切相关。第三部分，课题组制作携带CRYAA基因启动子rs7278468质粒，转染RPE细胞，研究发现细胞增殖行为明显抑制，CRYAA基因rs7278468位点的多态性与AMD相关性的具体作用机制研究后续实验将进一步展开。本项目围绕上述三部分研究，阐述了CRYAA在视网膜新生血管发生发展中的作用，并为探索眼内新生血管性疾病新治疗靶点奠定了基础。