saRNA介导的TRPV5表达在预防含钙尿路结石形成中的作用研究

含钙结石是最常见的尿路结石，而高钙尿是含钙尿路结石形成的一个重要因素，控制尿钙水平在含钙尿路结石的预防有重要地位。瞬时性受体电位通道vanilloid 受体5（TRPV5）是调节尿钙水平的主要离子通道。我们前期的研究发现TRPV5低表达会导致尿钙水平升高，结石形成机率增加。靶向作用于基因启动子的小双链RNA能够在转录水平上诱导基因持久的活化，这种现象叫做RNA激活（RNAa），这类RNAs被称为小激活RNAs（saRNA）。本研究通过RNAa技术使尿结石患者的TRPV5表达增高，降低尿钙水平，从而达到预防含钙尿路结石的目的。本实验拟设计筛选出高效能的TRPV5 saRNA，构建其PLGA纳米颗粒，分别转染体外肾小管上皮细胞及结石模型大鼠，测定TRPV5的RNA、蛋白表达水平及结石模型大鼠肾集合系统内的结晶数量，评估其预防尿路结石复发的效果，为其进一步用于预防含钙尿路结石提供理论依据。

含钙结石是最常见的尿路结石，而高钙尿是含钙尿路结石形成的一个重要因素，控制尿钙水平对于预防含钙结石具有重要意义。我们前期研究发现瞬时性钙通道转运蛋白TRPV5的低表达会导致尿钙水平升高，结石形成机率增加。近年来的研究发现靶向作用于基因启动子区域的小双链RNA能够在转录水平上诱导基因的持久活化，这种现象叫做RNA激活（RNAa），这类RNA被称为小激活RNA（saRNA）。因此本项目拟通过RNAa技术激活大鼠肾组织的TRPV5表达，从而降低大鼠尿钙水平并达到预防含钙尿路结石的目的，为临床含钙结石的防治提供新的实验依据和干预策略。. 我们按项目计划成功设计并筛选了针对人和大鼠的TRPV5小激活RNA，检测了所筛选的saRNA对人和大鼠肾小管上皮细胞TRPV5表达的激活效应以及对细胞钙离子转运的影响，并构建了大鼠TRPV5 saRNA的重组慢病毒质粒，通过输尿管逆行注射和大鼠草酸钙结石模型实现了大鼠肾脏的靶向转染，并检测了TRPV5 saRNA对大鼠肾脏草酸钙结石形成的影响及可能的机制。我们的实验结果显示：筛选的saRNA可以呈时间和剂量依赖性的特异性上调HK2和NRK-52E细胞TRPV5的mRNA和蛋白表达水平，并可以明显促进细胞的钙离子转运，部分逆转雄激素对细胞钙转运的抑制作用，而且saRA的激活效应具有明显的序列特异性；此外，大鼠肾脏靶向转染TRPV5 saRNA可以显著降低大鼠24h尿钙水平并抑制草酸钙结石的形成。. 在本项目中我们首次通过小激活RNA技术激活了钙离子通道蛋白TRPV5的表达，继而影响了细胞钙离子的转运和大鼠肾脏草酸钙结石的形成，亦是首次在RNA层面上对草酸钙结石的形成进行干预研究，有望为临床含钙结石的防治提供新的实验依据和干预手段。