miR146a-PAK6调控前列腺癌细胞微丝骨架与迁移运动的分子机制

微丝骨架是前列腺癌等恶性肿瘤细胞发生迁移与运动的结构基础。最近研究表明miRNA可抑制恶性肿瘤的转移，且具有新优势，但其分子机制未明。我们已经证实，PAK6参与调控前列腺癌细胞骨架及侵袭能力（Wen XQ，Urology,2009,73:1407-11）。本课题拟通过荧光素酶报告基因分析、激酶试验、RNA干扰等方法，通过分子、细胞及动物体内miRNA实验等,进一步探讨在HGF、Heregulin等外源性生长信号的刺激下，miR-146a如何调控PAK6介导的细胞骨架重构、应力纤维分布、伪足与膜皱褶形成、迁移能力改变、丝切蛋白（Cofilin）磷酸化，以及与转移相关的JNK/MMP9信号通路的机制。旨在从细胞骨架的角度，为临床开发miRNA治疗前列腺癌转移提供新的分子靶点与实验依据。

在本基金项目支持下，我们开展PAK6与前列腺癌转移的相关研究，顺利完成研究任务，成果如下：.（一）分子生物学研究.通过生物信息学预测PAK6是miR-23a的靶基因，进一步通过Real-time PCR、Western blot实验及荧光素报告酶实验，证实PAK6是miR-23a的靶基因。体外实验前列腺癌细胞系转染miR-23a后PAK6 mRNA表达量无明显减少，而PAK6蛋白表达量减少，说明miR-23a不影响PAK6基因的转录。通过Western blot实验检测发现前列腺癌细胞转染miR-23a后，LIMK1、Cofilin表达无明显变化，而p-LIMK1、p-Cofilin表达分别比对照组下降60%、70%，提示了miR-23a~PAK6~LIMK1~Cofilin信号通路的存在。进一步通过免疫荧光共定位、免疫复合物共沉淀实验（Co-IP）及激酶实验，证明PAK6与LIMK1直接相互作用。.（二）细胞学研究.在前列腺癌细胞系分别转染miR-control、miR-23a及siPAK6，通过激光共聚焦显微镜观察发现miR-23a组及siPAK6组细胞骨架应力纤维均明显减少，肌动蛋白皱缩，表明转染miR-23a后细胞骨架发生重构，细胞运动受抑制。体外迁移及侵袭实验示，转染miR-23a组迁移及侵袭的细胞数较对照组明显减少。提示转染miR-23a引起前列腺癌细胞侵袭及转移能力下降。同时过表达miR-23a与PAK6后，miR-23a所引起的效应均被逆转。.（三）动物实验.成功构建miR-23a及其海绵载体慢病毒细胞株，裸鼠原位注射稳定表达Luc-miR-23a及Luc-miR-control的前列腺癌细胞，建立动物模型。注射后每周行荧光活体成像，8周后处死小鼠。活体成像检测中证实miR-23a可以减弱小鼠体内前列腺癌的转移。.（四）临床前列腺标本及预后分析.人前列腺癌组织染色、原位杂交检测miR-23a；免疫组化检测PAK6表达。分析miR-23a/PAK6表达与临床生存率及预后关系，提示miR-23a的高表达与临床患者预后较好相关。.（五）较高浓度ROS可通过TAP与JNK信号通路交联促进PCa凋亡（Int J Cancer， Lab Invest）