TLR2影响角膜移植术后植片转归的机制研究

我们通过筛查移植术后角膜植片TLR2/TLR3/TLR4mRNA表达，发现TLR2mRNA在同种异体角膜移植术后第9天特异性升高，且证实与排斥反应的发生时间一致。因而推测TLR2可能与角膜移植术后非特异性免疫炎症向排斥反应转化有关。进一步实验显示移植后手术各组角膜植片存在不同程度的炎症反应，同种异体角膜移植排斥组最为严重，术后7-9天植片上皮细胞的TLR2分子由细胞浆向细胞膜表达增强，同时检测到TLR2下游信号分子MyD88mRNA特异性增高。由此，首次提出TLR2及其信号系统可能参与同种异体角膜移植术后排斥反应的新机制。本课题拟采用TLR2抗体处理移植后大鼠和TLR2基因敲除致免疫缺陷鼠进行角膜移植，观察植片的转归，以证实TLR2是移植术后非特异性炎症向排斥反应转化的关键因子，发掘排斥反应的治疗靶点；进一步运用RNA干扰技术阻断移植后TLR2的信号传递，为基因治疗临床应用提供实验依据。

作为天然免疫的主要模式识别受体，Toll 样受体（TLRs）通过识别病原相关分子模式下传信号，诱导免疫相关基因表达和分泌促炎因子，启动后天免疫系统，并在获得性免疫应答中发挥重要的调节作用。文献报道TLRs可能参与肾、皮肤等器官/组织移植术后免疫反应。我们的前期实验首次提示TLR2可能参与大鼠角膜移植术后排斥反应。本课题旨在进一步证实天然免疫受体TLR2及其信号系统参与异体角膜移植术后的排斥反应，并探索基因治疗的可能性。主要课题内容包括：分别采用TLR2单克隆抗体处理移植后大鼠(实验一)和TLR2基因敲除致免疫缺陷鼠(实验二)进行角膜移植，观察植片的转归，RT-PCR，免疫组化及流式细胞分析TLR2及下游信号MyD88 的mRNA和蛋白的表达，以证实TLR2是移植术后非特异性炎症向排斥反应转化的关键因子，进一步运用慢病毒载体介导RNA干扰技术阻断移植术后TLR2的信号传递(实验三)，评估植片的存活情况及siRNA的治疗效果，发掘排斥反应的可能治疗靶点。实验内容已经按计划完成，结果显示: TLR2单克隆抗体和慢病毒介导TLR2siRNA有效减少大鼠角膜植片TLR2及其下游信号MyD88的mRNA和蛋白表达，角膜植片炎症反应程度减轻，植片存活时间延长，证实了TLR2/MyD88信号系统参与了免疫排斥反应。TLR2基因敲除后小鼠角膜植片TLR2及其下游信号MyD88的mRNA和蛋白表达显著减少，角膜植片炎症反应程度轻，植片存活时间延长，证实了TLR2/MyD88信号系统参与了小鼠角膜移植后的免疫排斥反应。本课题首次应用TLR2单克隆抗体和慢病毒介导TLR2siRNA干扰技术抑制大鼠角膜移植术后排斥反应，首次应用TLR2基因敲除小鼠进行角膜移植排斥反应的研究，证实了天然免疫受体TLR2参与啮齿类动物角膜移植术后早期免疫反应的机制，为临床基因治疗提供了实验依据。