基于表观遗传学理论研究补肾中药对肾精亏虚雄性大鼠生殖衰老调控的DNA甲基化机制

Testis is an important organ which secretes male hormones and it’s closely associated with geriatric diseases and infertility.Under the guidance of Chinese medicine theory ‘the kidney controlling reproduction’,combining with the correlation of kidney essence,aging and gonadal axis,we used gene chip method found that: Heshouwuyin could influence 912 genes expression in aging rats testes,these genes were related to epigenetics,cell apoptosis and insulin signaling pathway,in addition,Heshouwuyin could promote the Leydig cells ability in secreting testosterone,we also found that several key genes of insulin signaling pathway,including IGF1,IR, IRS1, IRS2 and SOCS3 were regulated by Heshouwuyin via fluorescent quantitative PCR,immunofluorescence and western blot method.Therefore,we hypothesized that Chinese kidney-tonifying drugs -Heshouwuyin could inhibit spermatogenic cells apoptosis and delay senescence by regulating the epigenetic gene and insulin network nodes.In this project,sexual strain and panic male rats work as kidney essence deficient model,we plans to explore the DNA methylation mechnism of Chinese kidney-tonifying drugs in delaying reproductive aging of kidney essence deficient rats by means of DNA methylation microarray,methylation specific PCR and immunofluorescence technology,so as to enrich TCM Zangxiang theory:the kidney controlling reproduction.

睾丸是雄性激素产生的重要器官，性激素与DNA甲基化和衰老进程关系密切。本研究在祖国医学“肾主生殖”理论指导下，结合肾精盈亏与性腺和衰老的相关性，前期基因芯片筛选发现，补肾中药何首乌饮可使衰老大鼠睾丸组织表观遗传基因、细胞凋亡信号通路、胰岛素网络节点等相关的912个基因发生改变，且何首乌饮可促进睾丸间质细胞分泌睾酮。并且通过荧光定量PCR、荧光免疫和免疫印迹方法，证明了胰岛素网路节点关键基因IGF1、IR、IRS1、IRS2和SOCS3等受何首乌饮调控。因此，我们推测补肾中药何首乌饮通过调控表观遗传基因和胰岛素网络节点，抑制生精细胞凋亡，延缓肾精亏虚雄性大鼠生殖衰老。本项目以“房劳加惊恐”所致的肾精亏虚雄性大鼠为研究对象，运用DNA甲基化芯片及甲基化特异PCR技术结合荧光免疫染色等方法，旨在阐明补肾中药在肾精亏虚大鼠生殖衰老过程中的DNA甲基化机制，丰富“肾主生殖”中医藏象理论的科学内涵。

本课题围绕人口老龄化的严重社会问题，以生殖衰老是机体老化早期表现为主导，依据中医“肾藏精，肾主生长与生殖”藏像理论，以及“肾精盈亏”与衰老及老年疾病的密切相关性。本项目采用“房劳加惊恐”建立“肾精亏虚”大鼠模型，运用现代分子生物学技术，探讨了何首乌饮调控“肾精亏虚”大鼠睾丸生精功能的DNA 甲基化机制。研究表明“肾精亏虚”可导致大鼠血清睾酮含量、精子密度和活力显著降低；睾丸组织衰老标记物β-半乳糖苷酶、P16 表达明显升高；肾精亏虚雄性大鼠交配、授孕和生育指数明显下降；且受何首乌饮调控。为分析其机制，采用DNA甲基化芯片技术筛查出衰老大鼠睾丸组织中受何首乌饮直接调控的DNA甲基化差异表达基因群体有238个，分布在23条信号通路上；并通过MSP技术，验证了筛查出的AXL、C-myb、Ttc29、MAPK10、wnt2b基因甲基化水平在肾精亏虚大鼠睾丸组织中的变化特点与甲基化芯片一致。基因和DNA甲基化芯片发现衰老大鼠睾丸组织中Wnt/β-catenin 关键基因受何首乌饮调控，而该通路在精子发育中发挥重要作用，通过亚硫酸盐测序发现肾精亏虚大鼠睾丸组织中Wnt/β-catenin 通路关键因子 Sox17 和 Wdr5 甲基化水平和表达水平的改变与芯片结果一致，且受何首乌饮调控；在衰老的生精细胞中得出同样的结论。经分析基因甲基化水平和表达关系与其功能密切相关。细胞过度凋亡是细胞衰老的重要机制之一，我们通过BrdU免疫荧光和TUNEL染色观察到肾精亏虚大鼠睾丸组织细胞增殖明显降低，凋亡明显增加，且受何首乌饮调控，而这种调控作用与Apaf-1基因的甲基化水平密切相关。进一步明确了何首乌饮可提高肾精亏虚大鼠睾丸组织DNMTs 活性；敲低 DNMT1 或抑制 DNMTs 活性均可调控多个基因甲基化水平和基因的表达，诱导细胞衰老。本项目研究成果为肾精亏虚引起生精障碍的中西医病理机制的有机桥接和联系奠定理论和实验基础，揭示了中药药理作用、疾病 (证候) 靶点的部分生物学物质基础, 对中医药的应用与推广具有重大而深远意义。