土家药华中枸骨抗RA滑膜炎性增生活性物质及其NF-κB调节作用机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) is high prevalence and disability, so far,there have not been effective drugs to cure. inflammatory hyperplasia of RA synovial is the lesions center of RA. Based on nuclear transcription factor κB (NF-κB) signal path controled by the redox reaction,such as reactive oxygen species(ROS), Fibroblast-like synoviocytes (FLS) as acting targets to treat RA has become a hotspot of current drug researches. Tujia medicine Ilex centrochinensis(ICC) is always used for the treatment of RA,the research group has previously reported the low toxicity and the significant anti RA activity,The possible mechanism is attributed to enhance the activities of antioxidant enzymes in vivo and the free radicals scavenging activities in vitro,these finding prompted us to speculate that the action mechanism is associated with the regulation of the NF-κB pathway.Therefore,the aim of this project is intended to carry out research on active ingredients of anti inflammatory hyperplasia of RA synovial from Ilex centrochinesis and their mechanism, mainly includes: 1.in the principle of activity guides separation, isolate the anti RA active ingredient from ICC and identify the structure; 2. evaluate the anti RA activities with the strategy of combining application of CIA animal model in vivo and RA-FLS cell model in vitro; 3.based on the NF-κB signaling pathways, identify the anti RA action mechanism. Attempt to search for precursor compounds with better effects, less side effects and clear mechanism.

类风湿性关节炎(RA)患病率高、易致残，目前尚缺乏有效的治疗药物。滑膜炎性增生是RA进程中的病变中心。基于活性氧(ROS)等氧化还原反应调控的NF-κB信号通路，以滑膜成纤维细胞（RA-FLS）为靶点治疗RA已成为当前药物研究热点。土家药华中枸骨(Ilex centrochinensis,ICC)常用于治疗RA，课题组前期实验研究证实它毒性极低且疗效确切，其抗RA作用与其提高体内抗氧化酶活性和体外自由基清除作用有关，提示ICC抗RA作用机制与NF-κB信号通路相关。因此，本项目拟开展ICC抗RA滑膜炎性增生活性物质及作用机制研究，主要包括：1、采用活性导向分离原则，分离纯化及鉴定ICC抗RA活性成分；2、以体内CIA动物模型和体外RA-FLS细胞模型相结合评价活性成分抗RA活性；3、基于NF-κB信号通路，研究活性成分抗RA作用机制；以筛选出高效、低毒、作用机制明确的抗RA活性先导化合物。

本课题采用活性导向分离原则,分别以炎症动物模型,脂多糖诱导的RAW264.7细胞和TNF-诱导的人关节滑膜成纤维细胞MH7A模型进行活性筛选评价，采用多种色谱分离方法对活性部位纯化及活性成分分离，结果表明华中枸骨乙醇总提物具有很强的抗急性炎症和慢性炎症作用，显著提高慢性炎症大鼠血清中多种抗氧化酶的活性。其中石油醚部位和乙酸乙酯部位显著抑制LPS诱导的 RAW264.7炎症细胞NO的生成。总黄酮能剂量依赖性降低LPS诱导RAW264.7 细胞和TNF-诱导MH7A细胞培养上清NO水平以及IL-1β mRNA的表达，高浓度200 μg/mL可显著下调IL-6和IL-8 mRNA表达水平。进一步从其叶中分离得到21个化合物，其中6个新化合物，1个新天然产物，16个为首次从该植物中分离出来。从其根中分离得到16个化合物，2个为新化合物，14个为首次从冬青属植物中分离出来。化合物(2S)-5, 3', 4'-三羟基-7-甲氧基黄烷(1)，(2S)- 7,3',4'-三甲氧基-5-羟基黄烷(2)，(2S)-5,4'-二羟基- 7,3' -二甲氧基黄烷(3)，(2R)-7,3',4'-三甲氧基-5,8-醌黄烷(5)，(2S)-7-甲氧基-3'，4'-二羟基-5,8-醌黄烷(7)，5,7,4´-三羟基-3´-甲氧基黄烷-3-醇(9)，山奈酚(13)，槲皮素(14)能够抑制TNF-诱导MH7A细胞NO的生成。1、3、5显著抑制炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-8 mRNA表达。华中枸骨总黄酮为其主要的活性物质基础，化合物1、3、5为主要活性成分，作为抗RA活性先导化合物进一步深入研究。总黄酮类成分显著抑制P65蛋白磷酸化。已取得一批有影响的成果，共发表9篇论文, (均为第一标注基金资助)，其中SCI论文4篇，申请发明专利3项，授权2项，培养硕士毕业研究生3名，举行学术会议1次，超额完成预期研究成果。