玉米显性矮秆基因D11的克隆及其调控网络的解析

Dwarf stature is introduced to improve lodging resistance and harvest index during crop production. Maize dominant dwarf genes research focused on D8, D9, and Dt. Excavation and application of novel dwarf genes is urgent to overcome genetic bottleneck and vulnerability in maize breeding and basic research. To this end, we analyzed a newly identified maize dwarf plant. Main results were as follows. 1) The dwarf stature was controlled by a dominant gene D11 which is not allelic to well-characterized dominant dwarf genes D8, D9, and Dt. 2) D11 was delimited into a 143 kb interval containing four ORFs. 3) The suppressor of D11 was identified in maize inbred line Chang 7-2. In this project, we aimed at cloning and unraveling regulatory network of D11 gene. The goals of this project are to: 1) select candidate genes through a combined sequence character and expression analysis technique; 2) validate the candidate gene by transgenic method; 3) survey the expression pattern of D11 using qRT-PCR and Western blot strategy; 4) identify suppressor of D11 through the mutant-assisted gene identification and characterization (MAGIC) scheme; 5) unveil regulatory network of D11 based on integrated analysis of RNA-seq, microarray, and MAGIC data. Results from this project will enrich theoretical bases of plant height modulation. Additionally, results from this project will aid in crop genetic improvement and breeding, especially breeding of crops with plant height ideotype.

矮秆基因被用来增强作物的抗倒性与提高收获指数，玉米显性矮秆基因的研究集中于D8、D9、Dt，玉米显性矮秆基因的研究工作亟待拓宽矮秆基因的种质来源，丰富矮秆基因的遗传基础。本实验室对一份新的玉米显性矮秆材料进行了研究，结果表明：1）该矮秆性状受显性单基因D11控制，D11非D8、D9、Dt的等位变异；2）D11被精细定位在约143 kb范围内，含有4个ORF；3）自交系昌7-2中存在D11的抑制因子。在此基础上，本项目拟采用序列特征分析、基因表达分析，确定矮秆候选基因；通过遗传转化，验证候选基因功能；使用qRT-PCR、Western杂交，研究目的基因的表达模式；基于突变体辅助基因定位及表征分析MAGIC，发掘矮秆基因的抑制因子；综合转录组测序、基因芯片、MAGIC的结果，解析矮秆基因的调控网络。本申请项目旨在丰富株高调控的理论基础，也为理想株型育种工作提供理论参考与技术支撑。

矮秆基因与作物抗倒性和收获指数密切相关，玉米显性矮秆基因的研究集中于D8，玉米显性矮秆基因的育种应用与基础研究工作亟待拓宽矮秆基因的种质来源，丰富矮秆基因的遗传基础。本项目对玉米显性矮秆材料D11进行了研究，主要研究内容包括矮秆候选基因分离、候选基因功能验证、基因表达模式、矮秆基因抑制因子发掘、基因调控网络解析。主要结果如下：1）初定位区间分子标记开发结合重组单株基因型检测，D11定位于39 kb区间，该区间含有1个注释的基因。与B73、Mo17材料相比，矮秆材料D11中候选基因全长存在2处序列变异。2）设计两对guide RNA进行载体构建，获得13份CRISPR-Cas9编辑候选基因位点的材料。与野生型相比，CRISPR-Cas9编辑材料株高显著降低。3）与野生型相比，候选基因在D11中表达量显著降低。候选基因在玉米根、茎顶端分生组织、成熟茎、叶片中表达。候选基因编码蛋白在高世代回交分离群体株高正常植株叶片中丰度最高，在D11根中丰度最低。4）玉米塘四平头种质昌7-2中存在D11基因的抑制因子，但不是所有塘四平头种质（例如黄早四）中均存在D11基因的抑制因子。玉米SNP芯片检测郑58、昌7-2衍生的重组自交系群体基因型，结合D11与郑58、昌7-2衍生重组自交系群体杂交后代株高测定，D11基因的抑制因子被定位于SNP标记AX-123944761与AX-123944869之间。5）同一发育时期、同一组织、不同核背景（郑58、Mo17）高世代回交群体进行转录组测序。与株高正常株相比，郑58核背景下D11中发掘到306个差异表达基因（171个上调、135个下调）、Mo17核背景下D11中发掘到2537个差异表达基因（1120个上调、1417个下调）。qRT-PCR分析了差异表达基因。两种核背景下差异表达基因最显著富集的通路均与糖合成代谢运输相关。对不同核背景共同检测到的差异表达基因进行共表达分析，进一步发掘D11基因介导的调控网络。葡萄糖合成代谢酶基因pgm2、糖酵解重要酶基因GAPC1与互作因子构成了复杂的D11介导的差异表达基因共调控网络。本项目所得结果丰富了株高调控的理论基础，也为株型改良等育种工作提供了科学依据与实践素材。