绒山羊次级毛囊周期性生长相关基因的筛选及作用机制研究

On account of early study obout the molecular regulatory mechanisms of hair follicle growth and development in Inner Mongolia cashmere goats, combinningwith domestic and foreign research progress, we will take Inner Mongolia cashmere goats，the unique genetic resource in China，as the objects of research. This study will conduct the screening and identification of genes associated with the secondary follicle growth and development and its molecular regulatory mechanisms. The project plans to build mRNA expression library of skin follicle by sequencing on transcription level, then screen the candidate functional genes related to growth cycle of secondary hair follicle, we will test the mRNA and protein expression changes of candidate functional genes in cashmere goat secondary hair follicle growth cycle and explore the interaction mechanisms of target genes in secondary hair follicles of cashmere goat by using in situ hybridization on tissue, fluorescence quantitative real-time PCR and Western Blot, over expression techniques, et al. We are looking for candidate functional genes and the SNP sites associated with cashmere quality and performance of cahsmere goat populations by means of various technologies, such as PCR-SSCP and DNA sequencing.The purpose of this study is to reveal molecular mechanisms of cashmere goat secondary hair follicle cycle growth, which will provide molecular markers for breeding of high quality and yield cashmere goat strain rapidly and accurately.

基于本课题组前期对内蒙古绒山羊毛囊生长发育分子调控机理的研究基础之上，结合国内外研究进展，以我国特有遗传资源内蒙古绒山羊为研究对象，开展与次级毛囊生长发育相关基因的筛选鉴定及其分子调控作用机制的研究。本项目拟利用转录组测序建立皮肤毛囊mRNA表达文库，进一步筛选出与次级毛囊周期生长相关候选功能基因；利用组织切片原位杂交、荧光定量PCR 、Western Blot、过表达等技术手段，检测候选功能基因mRNA、蛋白质在绒山羊次级毛囊一年生长周期中的表达变化情况，探索目标基因在绒山羊次级毛囊生长中的作用机制；利用PCR-SSCP、DNA测序等技术寻找候选功能基因与绒山羊群体生产性能、绒毛品质等性状相关的SNP位点。研究结果旨在揭示绒山羊次级毛囊周期生长的分子作用机制，为快速、准确选育优质高产绒山羊品系提供分子标记。

本研究对绒山羊与奶山羊不同时期的皮肤样品进行了转录组测序，结合生物信息学方法对差异表达基因进行了分析，筛选出一些与次级毛囊周期性生长相关的候选基因，利用生物技术开展了候选基因的功能验证。主要结果如下：.（1）利用Illumina Hiseq2000 对绒山羊与奶山羊四个时期的皮肤样品进行了RNA-Seq测序。测序共获得38G数据，平均每个样品4.7G。.（2）检出绒山羊SNP总数为56231个，存在于10057个基因上。.（3）差异表达基因分析表明绒山羊与奶山羊间相同时期共有2409个差异表达基因，其中3月份共有350个差异表达基因，6月份共有220个差异表达基因，9月份共有427个差异表达基因，12月份共有1412个差异表达基因。.（4）绒山羊不同时期差异表达基因共550个，其中6月Vs 3月有146个差异表达基因，9月Vs 6月有98个差异表达基因，12月Vs 9月有83个差异表达基因，3月Vs 12月有223个差异表达基因。.（5）GO功能注释分类显示，差异表达基因主要富集在细胞、细胞部分、细胞器部分，通过结合、催化功能参与生物调控、细胞过程、代谢过程等生物过程。.（6）通过KEGG pathway分析，筛选出富集在与毛囊生长相关的WNT、SHH、TGFβ、TNF、MAPK和Notch信号通路中的差异表达基因。.（7）利用实时定量PCR检测了WNT通路中的8个基因、FOX基因家族的3个基因在毛囊周期生长过程中的表达变化情况，大部分基因在生长期的表达量较高，可能与毛囊周期性生长过程中毛囊生长期活动相关。.（8）利用Western blot技术检测了SFRP3、SFRP4、FoxE1和FoxN1的蛋白水平表达变化情况，其在3月、6月、9月和12月均表达，其中9月份表达量较高。.（9）利用免疫组化技术检测了SFRP4、FoxE1、FoxN1、Noggin基因在皮肤毛囊中的表达位置，结果显示主要表达于毛囊的外根鞘，兴盛期的信号表达强度较高。.（10）通过RNA干扰技术，在细胞水平上探索了SFRP4、FOXE1基因的作用机制，表明SFRP4、FOXE1表达被干扰后影响了其他相关基因的表达。.（11）利用PCR-SSCP技术对Noggin基因多态性与绒毛性状相关性进行分析，表明突变位点与内蒙古绒山羊的绒长存在显著相关。