基于iTRAQ技术CEA阴性结直肠癌肿瘤分子标志物的筛选与验证

Today, colorectal carcinoma (CRC), which is serious threats to people's health, has become one of the most important common tumors. Carcinoembryonic antigen (CEA) is the most widely used serum tumor marker, but its sensitivity is lower and its specificity is deficient to CRC. Up to now, it is an important issue that how to early diagnose the CEA-negative CRC through serological approach. Based on preliminary work, our topic group plan to research the cell lines and CRC patients between the CEA-negative and CEA-positive ones by using the newly developed iTRAQ quantity proteomics technology, in order to establish CEA related different-protein spectrums and screen the important protein. The Symbolic molecular would been validated on mRNA and protein level. The important key molecular would been validated their functions by using RNA interference and animal in vivo experiment. This research probably can provide some significant theory to screen the effective, sensitive, specific tumor marker of CRC.

结直肠癌已经成为危害人民群众健康最重要的常见肿瘤之一。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是结直肠癌应用最广泛的血清肿瘤标志物，但由于它灵敏度低、缺乏特异性，所以对CEA阴性结直肠癌的血清学诊断，至今仍然是困扰临床诊治的一个重要问题。本课题在前期组织蛋白质组学和分泌蛋白质组学的研究基础上，运用新近发展起来的iTRAQ定量蛋白质组学技术，研究CEA阴性、CEA阳性结肠癌细胞系差异蛋白表达谱以及血清CEA阴性、CEA阳性结直肠癌患者和健康人群的血清差异蛋白表达谱，筛选出细胞系之间、不同类别结直肠癌之间和结直肠癌与健康对照之间的相关差异蛋白,建立CEA相关的细胞系和人群血清的差异蛋白表达谱,并在细胞系与结直肠癌患者和健康人群中，对差异蛋白进行小规模标志性分子的表达验证，同时对关键分子进行功能验证，以期筛选出一些具有潜在价值的候选标志物。

应用iTRAQ技术，分析CEA阴性及CEA阳性结直肠癌组织蛋白组学研究，筛选出57个差异的蛋白质，其中下调17个，共同上调13个。选取选取10例CEA阴性癌组织和CEA阳性癌组织及其相应的癌旁组织，原代细胞培养,共筛出61个有差异的蛋白质，其中共同下调18个，共同上调16个.其中，我们选取了Annexin A5进行了分析，发现TNM Ⅲ/Ⅳ期的结肠癌患者血清Annexin A5含量高于TNM Ⅰ/Ⅱ期和正常人组，差异有统计学意义（p<0.05），Annexin A5表达与淋巴结转移密切相关（p<0.05）。血清Annexin A5的特异性明显高于CEA特异性（p<0.05），而其敏感性虽高于CEA敏感性，但无统计学差异（p>0.05）。通过细胞爬片免疫组化发现四株细胞中Annexin A5的表达量顺序为RKO> SW620>SW480>LS-174T，同时SW620与SW480的Annexin A5的表达量差别没有统计学意义。同时构建出shRNA9270-1，shRNA9271-2,shRNA9272-2三条Annexin A5沉默序列的RNAi慢病毒载体及一条阴性对照RNAi慢病毒载体，并且得到高浓度转染慢病毒颗粒。转染后，Annexin A5沉默后的RKO结肠癌细胞株的增殖率和平板克隆形成率提高。而且凋亡率下降，同时出现G2 / M期阻滞，但是对于癌细胞的侵袭、迁移及粘附能力无明显影响。并发现Annexin A5沉默后，RKO结肠癌细胞的Bax mRNA表达下量降，蛋白表达量无明显变化；Bcl-2的mRNA与蛋白表达量皆上升；磷酸化后的Erk1/2蛋白表达量上升。在临床上，：结直肠癌患者术前血浆TGF-β1水平明显高于术后组以及健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；肿瘤组织TGF-β1含量显著高于癌旁正常大肠组织（P<0.05）；在CEA阴性及CEA阳性患者中均可分别观察到类似的浓度改变。外周血TGF-β1水平与肿瘤大小呈正相关，随着肿瘤分期的进展，浓度明显升高。