基于肿瘤干细胞调节的清热解毒类食物黄酮对结直肠癌的预防和治疗作用机理

The incidence and mortality of colorectal cancer rank the third among the entire tumor, which is the most important disease affecting human health. The colon cancer stem cell plays vital roles in carcinogenesis and recurrence of colorectal cancer and may be a potential target for prevention and treatment of colorectal cancer.In TCM theory, "the accumulation of dampness-toxin" is an important mechanism in carcinogenesis of colorectal cancer and some studies showed that the "disperse heat and detoxification" herbs can inhibit the colorectal cancer and regulated the cancer stem cell related gene pathway. However, the stomach may be hurt if the "disperse heat and detoxification" herbs were used for long time. In our perivous study, some dietary flavanoid can inhibit the colorectal cancer. These dietary flavanoid can regulate the colon cancer stem cell? In our study,we will establish HT-29 colon cancer stem cell with green florence protein and establish a colon translocation orthotopic mice model. The dietary flavanoid extracted from food with "disperse heat and detoxification"effect will be used in the cancer stem cell and mice model. The formation, progression and metastasis are evaluated and the expression of Notch and WNT signal pathway will be detected by RT-PCR and Western-Blot, the epigenetic mechanism is evaluated by microRNA array and hypermethylator array. The results will declare the mechanism of dietary flavanoid on colon cancer stem cell and improve the study of Chinese herbs for colorectal cancer.

结直肠癌占肿瘤发生率和死亡率第三位，结肠癌干细胞在结直肠癌发生和复发中发挥重要作用，是潜在防治靶点。"湿热蕴结"是结直肠癌发生的重要病机，前期研究发现"清热解毒"中药如黄芩等具有抑制结直肠癌的作用，但是清热解毒中药多为苦寒药物，久用易伤及脾胃，具有"清热解毒"功效的食物其久用副作用较小，而且具有抑制结直肠癌作用，其是否具有调节结直肠癌干细胞的作用呢？本研究拟建立携带绿色荧光的HT-29结肠癌干细胞(GFP- HT-29)，建立GFP-HT-29结肠皮下易位结肠癌干细胞原位移植模型，使用具有"清热解毒"功效的食物黄酮成分处理细胞模型和动物模型,观察其肿瘤形成、生长和转移特点，并使用定量RT-PCR、Western-Blot检测Notch和WNT信号转导途径基因表达差异，使用甲基化芯片和MicroRNA芯片研究其表遗传学变化，阐明具有"清热解毒"功效的食物黄酮对结直肠癌干细胞作用和分子机理。

"湿热蕴结"是结直肠癌发生的重要病机，前期研究发现"清热解毒"中药如黄芩等具有抑制结直肠癌的作用，但是清热解毒中药多为苦寒药物，久用易伤及脾胃，具有"清热解毒"功效的食物其久用副作用较小，而且具有抑制结直肠癌作用，其是否具有调节结直肠癌干细胞的作用呢？本研究拟建立携带绿色荧光的HT-29 结肠癌干细胞(GFP- HT-29)，建立GFP-HT-29 结肠皮下易位结肠癌干细胞原位移植模型，使用具有"清热解毒"功效的马齿苋提取物等食物黄酮成分处理细胞模型、原位移植模型动物模型,观察其肿瘤形成、生长和转移特点，并使用定量RT-PCR、Western-Blot等方法检测Notch等信号转导途径基因表达差异;发现经无血清培养后，HT-29细胞呈梭形细胞，而HT-29干细胞呈球形生长；hoechest33342染色后，HT29干细胞相对于HT29细胞有明显的核拒染现象;HT-29干细胞相对于HT29细胞对5-FU有明显的耐药作用，HT29细胞IC50值为1.394 ug/ml ，HT29干细胞的IC50值为13.087ug/ml， IC50值有明显的增高;HT-29干细胞体内生长速度比HT-29细胞体内生长速度显著要缓慢， HT-29细胞的肿瘤体积是HT-29干细胞肿瘤体积的2倍多；HT-29干细胞在小鼠富血管区（腋下和腹股沟淋巴结）的生长速率比皮下生长速率有明显的提高，但与HT29细胞的生长速率还有明显差距;其作用机制与诱导凋亡和影响细胞周期，经2.25μg/m L马齿苋提取物处理后，HT-29细胞及HT-29干细胞的Notch1、Notch2、β-catenin蛋白呈现下调趋势；进一步在结直肠癌人中理解可能的分子机理改变，使用MicroRNA 芯片研究结直肠癌相关表遗传学变化，发现miR-18a-5p、miR-21-3p和miR-133a-3p在腺瘤和癌均上升或下降，在结直肠癌发生和发展中重要意义;定量RT-PCR分析发现血清miR-20a和miR-486在CRN患者中比在健康对照中显着下调（倍数变化= 0.697和0.696，分别为P = 0.01和0.05）。检测血清miR-92a在两组之间没有差异表达，血清miR-135b因水平太低而不能精确定量。血清miR-486在管状绒毛膜腺瘤（TVA）和高级上皮内瘤变（HGIN）患者中比对照组下调。