欧美杨溃疡病菌Lonsdalea quercina双组分系统在致病与寄主适应过程中的功能研究

A new canker disease of Populus × euramericana caused by Lonsdalea quercina was first discovered in China in 2006. The disease is more destructive to poplar than the other types of poplar canker. Effective bactericides for the pathogen have not found yet. Two-component systems (TCSs) are the most important sensors and signal transduction pathways for the perception of environmental stimuli of bacteria. They play vital roles in the growth, stress response, host adaptation, the virulence, chemotaxis, the biofilm formation, quorum sensing and so on. This project aims to identify and functionally characterize two-component systems to reveal the molecular mechanism in L. quercina. Bioinformatics analysis helps to identify histidine kinases and response regulators of TCSs and uncover the phylogenetic relationships of TCSs among relatives. The deletion mutants of each HK or RR will be functionally characterized. We focus on the TCSs involved in the regulation of the pathogenicity and host adaptation. Key transcription factors, host adaptation and pathogenicity-related genes downstream of TCSs will be further explored by proteomics and molecular biology methods. The results will shine a light on how L. quercina colonizes and infects the poplar. Drug targets and control strategies of the disease will be hunted for. Meanwhile, it is tried to set up a model system in forestry pathology for interaction between woody trees and pathogenic bacteria and also provide a reference for the study on other bacterial diseases of trees.

由Lonsdalea quercina引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现，不同于杨树水泡型溃疡病与冰核细菌溃疡病，该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏，已造成了严重的经济损失且无有效防治措施。双组分系统是细菌重要的信号传递通路，在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。本项目拟开展L. quercina双组分系统的功能研究，通过分子遗传学与基因组学相结合的方法，分析该病菌双组分系统的组成结构和系统发育进化及其生物学功能；采用蛋白质组学方法系统筛选该病原菌双组分系统下游的关键转录因子、致病基因和逆境胁迫应答基因，阐明双组分系统调控该病菌在致病过程和逆境胁迫下的寄主适应性的分子机理，为揭示L. quercina侵染欧美杨的病理学机制，筛选有效的药物靶标、设计病害控制策略提供新思路和理论基础；也为其他林木细菌性病害的分子植物病理学研究提供参考和借鉴。

由Lonsdalea quercina引起的欧美杨细菌性溃疡病在其主要种植区河南、山东大面积爆发，在天津、宁夏也有出现，是国内近年来发现的一种新的杨树细菌性病害。对该病原菌的致病机理及成灾机制尚无探讨。在细菌的信号响应与应答调控机制中，双组分信号转导系统是最重要的分子调控机制之一。在感受环境刺激，调控细菌生长发育及致病性等生理生化过程中发挥重要作用。本项目通过全基因组测序及生物信息学分析鉴定出18个受体组氨酸激酶和24个反应调节蛋白。将其编码基因插入失活，其中19个基因与病原菌致病性直接相关，26个基因参与病原菌游动性调控。本研究主要揭示了三个双组分信号转导分子的功能，着重阐述了其中两个信号分子的调控机制及其调控的下游信号网络。通过同源重组获得缺失突变体ΔLqp0375、ΔLqp0376和ΔLqp2312，ΔLqp0375和ΔLqp2312以及Lqp0376过表达突变体对欧美杨致病性较野生型显著下降。ΔLqp2312突变体游动性和生物膜形成能力明显下降，提示Lqp2312参与调节该细菌致病性及致病性相关性状；ΔLqp0375和Lqp0376过表达突变体的游动性及其在饥饿、氧化压力和氯霉素胁迫下的耐受性下降。进一步实验证明Lqp0375（后命名为KdpE）和Lqp0376（后命名为KdpD）位于同一操纵子内，是一对可以相互结合的双组分信号转导系统成员。KdpD作为组氨酸蛋白激酶具有自激酶活性但对下游调节蛋白KdpE不具有磷酸转移酶活性。为了揭示调节蛋白KdpE对下游信号分子的调控机制，采用ChIP-Seq技术获得了14大类共计44个受调控基因，主要参与致病性、适生性、物质转运、细胞结构、物质能量代谢等途径。从中选取3个逆境胁迫应答基因，采用EMSA技术证实KdpE和这些基因的启动子可直接结合，RT-PCR检测发现KdpE正调控这些基因的转录水平，揭示了KdpE以转录因子形式对这些基因的转录水平进行调节从而应答环境信号刺激的调控机制。过表达这三个下游基因可以恢复KdpE缺失突变体对氯霉素胁迫的耐受性，从生物学功能上证明了其信号通路的上下游关系。本研究结果为深入探讨病原菌致病分子机理和成灾机制奠定了扎实的基础，同时也提出了新的科研问题和研究视角。