肌浆网蛋白Nogo-C在心肌细胞肌浆网钙稳态调节过程中的作用及其机制研究

Calcium homeostasis disregulation plays a pivotal role in the pathogenesis of myocardial infarction induced ventricular arrhythmias. Nogo-C is a sarcoplasmic reticulum (SR) protein, we have proved that Nogo-C induced cardiomyocyte apoptosis in the pathogenesis of early period of myocardial infarction. Our preliminary data shows that Nogo-C decreases SR calcium content in cardiomyocyte, however, the exact mechanisms of Nogo-C in calcium homeostasis regulation and its role in pathogenesis of arrhythmia still remains to be elucidated. We will perform gain-of-function and loss-of-function study in primary-cultured mouse adult cardiomyocytes and focus on the relationships between Nogo-C and the classical proteins mediating SR calcium homeostasis to explore the mechanisms underlying Nogo-C’s function on SR calcium homeostasis regulation in vitro. Mouse adult cardiomyocytes will be loaded with cytoplasma and SR calcium indicators together with confocal microscope to detect the effect of Nogo-C on cytosolic or SR calcium homeostasis regulation, including SR calcium content and calcium leak. 45Ca uptake experiment will be used for the measurement of cardiomyocyte SR calcium uptake capacity. Additionally, through using Nogo-C-/- mice, this project will further explore the role of Nogo-C in pathogenesis of calcium homeostasis disregulation related ventricular arrhythmias. This study will identify the key role of Nogo-C in cardiomyocyte SR calcium regulation, and further provide a novel insight into the future therapy for myocardial infarction-induced arrhythmias.

心肌细胞肌浆网钙稳态调节紊乱是心肌梗死致室性心律失常重要的发病机制。Nogo-C是肌浆网蛋白，我们的前期研究发现，在心梗早期Nogo-C表达升高，促进心肌细胞凋亡，抑制心肌舒缩功能，预实验结果显示Nogo-C过表达可以降低肌浆网钙离子的含量，但其调控钙稳态的机制以及在心律失常发生过程的作用尚不清楚。本项目拟在培养的小鼠心肌细胞中过表达和敲除Nogo-C，并以肌浆网上重要的钙活动调节蛋白为靶点，在细胞水平探讨Nogo-C调节肌浆网钙稳态的机制，使用钙荧光探针结合激光共聚焦显微镜分别检测胞浆和肌浆网钙浓度变化，探索Nogo-C对肌浆网钙离子含量的影响以及在肌浆网钙离子渗漏过程的作用；采用45Ca重吸收实验检测Nogo-C对心肌细胞肌浆网钙回收的作用；进一步采用Nogo-C基因敲除小鼠探索其在钙稳态紊乱所致室性心律失常中的作用。本研究旨在为防治钙稳态调节紊乱相关心律失常提供新的思路和靶点。

心肌细胞肌浆网钙稳态调节紊乱是心肌梗死致室性心律失常重要的发病机制。Nogo-C是肌浆网蛋白，我们的预实验结果显示Nogo-C过表达可以降低肌浆网钙离子的含量，在此基础上，我们按照项目的研究计划展开研究，结果发现：过表达Nogo-C的心肌细胞，自发性钙火花以及钙波发生频率增加；以Ruthenium Red抑制RyR介导的钙离子渗漏，同时以thapsigargin抑制肌浆网钙回收后，过表达Nogo-C可以加速肌浆网钙离子浓度下降，这些结果提示，Nogo-C通过RyR以外的其他通道增加肌浆网钙渗漏引起肌浆网钙库含量降低。机制研究发现，过表达Nogo-C导致钙渗漏蛋白Sec61表达量增加，而免疫共沉淀证实Nogo-C与Sec61蛋白存在相互作用，分子生物学实验进一步发现，Nogo-C是通过Sec61α的Loop6和Loop8结构域与其发生相互作用的，且Nogo-C与Sec61蛋白的结合抑制了Sec61与泛素分子的结合。过表达Nogo-C的心肌细胞，以Sec61抑制剂anisomycin处理，或以si-Sec61α敲低Sec61，均可以逆转Nogo-C引起的肌浆网钙库含量降低、心肌细胞收缩力降低以及自发性钙火花及钙波的增加，提示Nogo-C通过抑制Sec61泛素化，增加肌浆网钙渗漏。动物实验结果显示，与对照小鼠相比，Nogo-C基因敲除小鼠心肌梗死后心律失常发生率明显降低。此外，对心肌细胞以及离体灌流的心脏进行高频电刺激后，我们同样发现Nogo-C基因敲除可以抑制舒张期自发性收缩以及心律失常的发生。本研究为防治钙稳态调节紊乱相关的心律失常提供了新的思路和靶点。