天然抗氧化剂儿茶素抗白色脂肪组织血管生成作用及其分子机制研究

脂肪细胞能分泌血管生成因子促进白色脂肪组织血管生成，血管形成和脂肪组织形成密切相关，因此，抑制血管生成成为肥胖防治的新靶点。本课题前期研究提示抗氧化剂可防治营养性肥胖大鼠代谢并发症，并影响脂肪因子分泌。本课题拟以此为基础，以被证实可防治肥胖的天然抗氧化剂茶多酚抗血管生成的初步研究结果为背景，以氧化应激、抗氧化剂对白色脂肪组织血管生成的作用为核心，研究茶多酚的主要成分茶儿茶素对饮食诱导大鼠肥胖及代谢紊乱的防治作用，分析氧化应激、抗氧化剂对白色脂肪组织血管密度、血管生成因子分泌的影响。同时采用细胞共培养技术，以脂肪细胞为饲养层，研究氧化应激、抗氧化剂对脂肪细胞VEGF表达、内皮细胞VEGF受体表达及下游信号分子表达的作用。在此基础上，采取信号阻断方法，探索氧化应激等调控因素是否通过VEGF/VEGFR2/Pl3K/AKT信号转导通路参与调控脂肪组织血管生成，为肥胖病的防治探索新理论和新方法。

围绕着抗氧剂儿茶素主要成分---表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）对脂肪组织生成和血管生成作用及其分子机制，本课题采用细胞培养、动物实验以及鸡胚绒毛尿囊膜进行了研究。采用血管生成体内实验的鸡胚绒毛尿囊膜模型研究，记录各EGCG干预组CAM血管生长情况，用人工计数血管交叉点(VN)，计算机扫描并分析血管生成面积与鸡胚尿囊膜面积并计算两者之比(VA/CAM)两种方法，我们发现EGCG可抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长，并具有量效关系；细胞培养实验发现，与对照组相比，0.5µg/ml~50µg/ml EGCG刺激均对3T3-L1前脂肪细胞的增殖显著的抑制作用（P<0.05），且该作用呈现一定的剂量依赖关系；虽然≤10µg/ml的EGCG刺激对3T3-L1前脂肪细胞的分化没有明显的影响，但是高达25µg/ml的EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化（P<0.05）。5µg/ml~50µg/ml EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞的细胞上清液中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌；免疫荧光实验结果显示，VEGF在3T3-L1脂肪细胞中的表达比与3T3-L1前脂肪细胞更多；Western Blotting和实时荧光定量PCR结果显示，EGCG能显著降低3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞中VEGF、PPARγ、C/EBPα的蛋白mRNA表达；建立3T3-L1细胞和HUVEC的共培养体系，采用xCELLigence实时细胞分析系统观察3T3-L1细胞对HUVEC增殖的影响，并采用三维培养观察EGCG培养的3T3-L1脂肪细胞上清液对HUVEC细胞小管生成的影响，结果发现3T3-L1细胞能刺激HUVEC的增殖，25µg/ml的EGCG处理的3T3 -L1脂肪细胞的细胞上清液能够抑制HUVEC小管生成。EGCG对营养性肥胖大鼠的肥胖控制实验表明，综合EGCG对体重、血糖、血脂以及脂肪变性的控制作用，EGCG 200mg/kw或3.2mg/g（diet）为比较理想的干预剂量。EGCG灌胃喂饲10w干预后，高脂造模组（DIO组）大鼠血清VEGF浓度高于正常对照组，而EGCG 抗氧干预降低血清VEGF浓度。正常对照组、DIO组及抗氧化干预组大鼠