谷氨酸转运体4b-4c环在转运底物过程中的构象变化及功能分析

We already illuminated that helical hairpin(HP)2 acts as outer gate for excitatory amino acid transporters (EAATs). The conformational changes of HP1 during glutamate transporters opening to cytoplasm were revealed by us. However the transport mechanism of EAATs and the conformational changes and function of 4b-4c loop during the transport cycle is not completely clear until now. In our current study we found that the conformation of 4b-4c loop undergoes great changes during the transport cycle, and 4b-4c loop is correlated to the substrate transport. So we hypothesize that 4b-4c loop has certain function for the substrate transport. The conformation of 4b-4c loop undergoes great changes during the transport cycle, which supporting HP1, HP2, TM7 conformation change to execute substrate transport. Meanwhile some amino acid residue sites may be involved in the transport pathway. We are going to verify this hypothesis using the site-directed mutagenesis, cysteines cross linking, circular dichroism (CD) and size exclusion chromatography (SEC). From these researches we will try to analyze the conformational changes of 4b-4c loop during the transport cycle, reveal the relationship between the amino acid residue sites of 4b-4c loop and transport pathway, clarify the function of 4b-4c loop during the transport cycle, identify molecular determinants of the differences of the transport mechanism between prokaryotes and eukaryotes glutamate transports. The finding of this project may provide theoretical basis to illuminate the transport mechanism of EAATs.

我们前期已经证明发夹结构HP2是真核生物谷氨酸转运体(EAATs)细胞外侧闸门，揭示了细胞内侧闸门HP1向胞浆开放的构象变化。然而EAATs转运机制还没有完全阐明，结构区段4b-4c环在转运底物过程中的构象变化及功能仍不清楚。我们进一步研究发现4b-4c环在转运底物过程中构象发生了较大改变，而且与底物转运密切相关。据此我们推测：4b-4c环对底物的转运具有一定的功能。4b-4c环支撑HP1、HP2、TM7构象变异完成底物转运，同时其部分位点可能参与了转运通道的组成。为验证推测本项目拟用定点突变、半胱氨酸突变对交联、圆二色光谱、体积排阻色谱等方法对4b-4c环进行研究，剖析4b-4c环在转运底物过程中的构象变化，揭示4b-4c环位点与底物转运通道的关系，阐明4b-4c环在底物转运中的功能，阐述原核与真核谷氨酸转运体转运机制差异的分子结构基础。对完全阐明EAATs的转运机制提供一定的理论基础。

本项目研究表明EAAT1 4b-4c环与底物转运通道关系中，Q189C、A243C和L244C位点可能参与转运通道的组成。我们发现突变体F190C、V238C和A243C是暴露细胞外液或者处于转运通道中而Q189C和L244C则暴露细胞内液之中；膜蛋白表达减少造成突变体A243C和L244C转运活性受损。底物KC1增强了L244C对MTSEA的抑制效应而底物L-Glu却能保护MTSEA的抑制效应，我们推测L-Glu和KC1促进转运体对L244C内开放时相的机制不相同。.我们的研究表明，I93C/V241C和I97C/V241C突变体的位点空间距离十分靠近。在不同细胞外介质（谷氨酸盐或K+）作用下，二者对氧化抑制的反应是一致的，在谷氨酸转运体向胞内开放和向胞外开放时开放比例增加，说明TM4区段的Val-241位点与TM2区段的Ile-93和Ile-97位点是相互靠近。位于TM4上的Ala -243位点和TM7上的Thr -396位点在谷氨酸转运体向胞内开放和向胞外开放时也是相互靠近的。这表明在转运过程中TM4b-4c环与TM7之间发生底物诱导的结构重排。对于TM4上A243C位点，谷氨酸转运体向胞内开放，TM4上的Ala243位点和TM8上的Ile469位点是相互远离的。.对EAAT1 TM4b-4c环的疏水性分析发现，TM4b端的T192和Y194残基所在区域具有高度亲水性，它们在细胞膜上的EAAT1表达水平显著降低，而TM4c端的N242和G245残基所在区域则仅表现出轻微的疏水性，其膜蛋白表达量并无下降，说明N242A和G245A的转运活性受损并不是由于膜蛋白表达减少造成，可能是突变蛋白内在的功能缺陷所致；这四个丙氨酸突变体在底物的转运中有重要的作用。.本项目研究进一步阐明了4b-4c环在与底物转运过程中构象变化的关系，揭示了Q189C、A243C和L244C位点是底物转运的关键位点。在GLT-1转运底物过程中TM4区段并不是单一作用的，TM4和TM2、TM7和TM8发生复杂的相互运动，共同参与和协调转运的过程。本项目还鉴定了TM4b-4c环上的T192、Y194、N242及G245位点，并证明它们参与了底物转运。